通心絡(luò)對(duì)同型半胱氨酸損傷的內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及NO-caveolin-1在其中的作用.pdf

1、研究背景： 冠狀動(dòng)脈粥樣硬化心臟病(coronary atherosclerosis heart disease，CHD)是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的疾病，其病理基礎(chǔ)是動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)。近年來(lái)的研究表明，內(nèi)皮功能障礙是AS的始動(dòng)因素，貫穿AS發(fā)生、發(fā)展的全過(guò)程。多種病理因素(如機(jī)械、化學(xué)、免疫等)直接損傷內(nèi)皮細(xì)胞，使內(nèi)皮細(xì)胞釋放的血管活性物質(zhì)和細(xì)胞因子之間的平衡紊亂，進(jìn)一步促進(jìn)血管收縮、血管通透性增加

2、、血小板聚集、脂質(zhì)氧化、平滑肌細(xì)胞增殖、白細(xì)胞粘附和血栓形成最終引起AS。因此，保護(hù)血管內(nèi)皮、防治內(nèi)皮功能障礙已成為防治AS的研究重點(diǎn)。 血漿同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)水平升高是引發(fā)AS病變的主要原因之一，被認(rèn)為是AS的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。Hcy通過(guò)損傷內(nèi)皮細(xì)胞、促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)、激活炎癥反應(yīng)等各個(gè)階段促進(jìn)AS形成。其中，Hcy對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷一直都是高同型半胱氨酸血癥致AS的研究重點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)H

3、cy主要是通過(guò)抑制內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)活性，使一氧化氮(nitric oxide，NO)產(chǎn)生減少、生物活性下降，引起血管內(nèi)皮功能障礙，最終導(dǎo)致AS發(fā)生。但是，Hcy損傷內(nèi)皮細(xì)胞、導(dǎo)致AS發(fā)生的內(nèi)在機(jī)制尚未完全闡明。 Caveolae是在細(xì)胞質(zhì)膜上的50-100 nm大小的小凹樣結(jié)構(gòu)，存在于體內(nèi)多種細(xì)胞類(lèi)型中，特別在內(nèi)皮細(xì)胞中富集。Caveolin-1

4、是caveolae的特征性結(jié)構(gòu)蛋白，保持caveolae的Ω形態(tài)。Caveolae和caveolin-1參與多種細(xì)胞功能，包括多種運(yùn)輸過(guò)程如跨胞運(yùn)輸、胞吞和胞吐作用、維持脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)、維持糖類(lèi)和蛋白代謝平衡并調(diào)節(jié)多種信號(hào)傳導(dǎo)通路，在AS的發(fā)展中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，caveolin-1可以抑制或誘導(dǎo)eNOS的活性，這種矛盾現(xiàn)象引起學(xué)術(shù)界的興趣。但是，Hcy損傷內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)程中caveolin-1與eNOS的變化及機(jī)制尚未闡明。 通心絡(luò)

5、(Tongxinluo，TXL)是依據(jù)絡(luò)病理論將不同類(lèi)別通絡(luò)藥物有機(jī)組合研制而成的中藥復(fù)方制劑。通心絡(luò)由人參、全蝎、蜈蚣、蟬蛻、水蛭、土鱉蟲(chóng)、赤芍、降香和冰片等藥物組成，以絡(luò)虛通補(bǔ)藥為主，輔以蟲(chóng)類(lèi)化瘀通絡(luò)藥、搜風(fēng)通絡(luò)藥和辛香通絡(luò)藥組方。該方劑具有益氣活血、搜風(fēng)通絡(luò)之功效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實(shí)TXL通過(guò)抗氧化應(yīng)激、抗血小板、抗凝、抗炎等途徑直接及間接保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能，同時(shí)TXL具有調(diào)脂、協(xié)同降壓、降糖、降Hcy等延緩AS進(jìn)展的功能。

6、盡管臨床觀察及部分動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TXL可通過(guò)保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞防治AS，但目前具體機(jī)制尚未完全明了。迄今為止，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)關(guān)于TXL對(duì)Hcy損傷內(nèi)皮細(xì)胞功能的保護(hù)作用以及NO/Caveolin-1機(jī)制的研究。鑒于NO/Caveolin-1在AS發(fā)病機(jī)制中的重要性，我們?cè)O(shè)想以此為突破口，探討TXL抗AS的新的作用機(jī)制。 研究目的： 本研究通過(guò)建立Hcy損傷人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endotheli

7、al cells，HUVECs)模型，觀察TXL對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用，以阿托伐他汀(atorvastatin，ATV)為對(duì)照藥物，探討NO/caveolin-1在此過(guò)程中的作用，為T(mén)XL應(yīng)用于臨床防治AS提供新的實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。 方法： 1.HUVECs培養(yǎng)及鑒定：新鮮臍帶取自健康孕婦，分離HUVECs，培養(yǎng)，傳代，取第2-4代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。取第2代細(xì)胞采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面CD34抗原表達(dá)鑒定內(nèi)皮細(xì)胞。

8、2.噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞活力：觀察不同濃度Hcy、TXL和ATV作用于HUVECs48 h后的細(xì)胞活力。 3.NO、MDA水平和SOD活性檢測(cè)：將細(xì)胞隨機(jī)分成4組：1)對(duì)照組；2) Hcy組(0.5 mmol/L)；3)TXL組(TXL5 mg/ml+Hcy0.5 mmol/L)；4) ATV組(ATV10μmol/L+ Hcy0.5 mmol/L)．處理48h后，取各組細(xì)胞培養(yǎng)液，分別檢測(cè)各組的NO、MDA水平和SOD活

9、性。 4.熒光實(shí)時(shí)定量RT—PCR(Real—time RT—PCR)方法檢測(cè)eNOS和caveolin-1的mRNA表達(dá)。采用與方法4相同分組、藥物劑量作用48h后，收集細(xì)胞，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行Real time PCR檢測(cè)eNOS、caveolin-1的mRNA表達(dá)水平。 5.免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)eNOS和caveolin-1的蛋白表達(dá)。采用與方法4相同分組、藥物劑量作用48

10、h后，收集細(xì)胞，提取總蛋白，進(jìn)行Western Blot檢測(cè)eNOS、caveolin-1的蛋白表達(dá)水平。 6.數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0軟件包。組間比較用單因素方差分析(One way ANOVA)，多重比較用LSD法。P<0.05表示差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1.HUVECs培養(yǎng)及鑒定結(jié)果：形態(tài)學(xué)上內(nèi)皮細(xì)胞分布均勻，單層生長(zhǎng)，形態(tài)為多角形、梭形或

11、橢圓形，呈鋪路石樣鑲嵌排列；利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面CD34抗原發(fā)現(xiàn)，99.6％細(xì)胞表達(dá)CD34。鑒定結(jié)果為內(nèi)皮細(xì)胞。 2.MTT法檢測(cè)結(jié)果： 1)加入6個(gè)不同濃度的Hcy(0.1～1 mmol/L)處理48h后發(fā)現(xiàn)，隨著Hcy濃度增大，細(xì)胞活力逐漸減弱，與正常組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)； 2)在Hcy(0.5 mmol/L)處理的同時(shí)加入8個(gè)不同濃度的TXL(1～8 mg/ml)處理48h后發(fā)

12、現(xiàn)，隨著TXL濃度增大，細(xì)胞活力逐漸增強(qiáng)，與Hcy正常組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)； 3)在Hcy(0.5 mmol/L)處理的同時(shí)加入4個(gè)不同濃度的ATV(0.1～100μmol/L)處理48h后發(fā)現(xiàn)，隨著ATV濃度增大，細(xì)胞活力逐漸增強(qiáng)，與Hcy正常組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 3.NO水平檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)Hcy組HUVECs的NO水平低于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TXL組

13、HUVECs的NO水平高于Hcy組之間，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但與ATV組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 4.SOD活性和MDA水平檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)Hcy組HUVECs的SOD活性明顯低于正常組，MDA水平明顯高于正常組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TXL組的SOD活性明顯高于Hcy組，MDA水平明顯低于Hcy組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但與ATV組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

14、5.熒光實(shí)時(shí)定量RT—PCR方法檢測(cè)eNOS和caveolin-1的mRNA表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.5mmol/L Hcy可顯著抑制HUVECs的eNOS mRNA表達(dá)，誘導(dǎo)caveolin-1 mRNA表達(dá)，與正常組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；5 mg/ml TXL可顯著提高Hcy處理的HUVECs的eNOS mRNA表達(dá)，抑制caveolin-1 mRNA表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與ATV組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>

15、0.05)。 6.免疫印跡法檢測(cè)eNOS和caveolin-1的蛋白表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.5 mmol/LHcy可顯著抑制HUVECs的eNOS蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)caveolin-1蛋白表達(dá)，與正常組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)：5 mg/ml TXL可顯著提高Hcy處理的HUVECs的eNOS蛋白表達(dá)，抑制caveolin-1蛋白表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與ATV組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 結(jié)

16、論： 1.Hcy可能通過(guò)氧化應(yīng)激、破壞NO系統(tǒng)，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞活力下降和內(nèi)皮功能損傷。 2.TXL可能通過(guò)提高SOD活性，清除氧自由基并維持NO系統(tǒng)平衡從而保護(hù)內(nèi)皮功能。 3.Hcy可促進(jìn)HUVECs caveolin-1的基因和蛋白表達(dá)，抑制eNOS的基因和蛋白表達(dá)，從而減少NO的產(chǎn)生。 4.TXL可促進(jìn)HUVECs eNOS的基因和蛋白表達(dá)，抑制caveolin-1的基因和蛋白表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)eNOS活性，