不同方式負載抗原后外周血樹突狀細胞對口腔癌抑瘤作用的體內外實驗研究.pdf

1、目的：研究口腔癌患者外周血單核細胞來源的樹突狀細胞(dendriticcell，DC)的形態(tài)、表型和功能，分析患者性別、年齡、腫瘤的大小、臨床分期、病理類型、分化程度及有無淋巴結轉移等臨床病理因素對DC功能的影響，了解口腔癌患者DC的功能狀態(tài)，研究經(jīng)不同方式負載抗原對DC形態(tài)及功能的影響，探討DC介導的特異性抗腫瘤應答機制，以期為口腔癌的生物治療提供實驗基礎。 方法 第一部分不同臨床因素對口腔癌患者外周血樹突狀細胞生物學

2、特性的影響研究 選取2005年3月-2006年7月在我院口腔科住院的30例原發(fā)口腔癌患者為研究對象(A組)，均無其他系統(tǒng)性疾病，其中男性19例，女性11例；年齡為30-60歲，中位年齡49歲；Ⅰ期忠者6人，Ⅱ期患者8人，Ⅲ期患者11人，Ⅳ期患者5人；腫瘤最大8cm×5cm×4cm，最小1．5cm×1．0cm×0．3cm；鱗癌21例，腺癌9例；高分化+中分化癌患者23例，低分化+未分化癌患者7例；有淋巴結轉移者12例，無淋巴結轉移

3、者1 8例。對照組選用30例健康志愿者(B組)。采集A和B組每位受試者外周血50ml，分離單個核細胞，用GM-CSF，IL-4體外誘導培養(yǎng)5天，隔天換液并計數(shù)。第7d在培養(yǎng)體系內加入TNF-α，繼續(xù)培養(yǎng)，分別于第5、7、10、14天獲取DC。培養(yǎng)過程中用倒置顯微鏡、掃描電鏡、透射電鏡觀察DC的表面形態(tài)及內部結構變化；用流式細胞術檢測DC表面分子CD1a、CD83、CD80、C1986和HLA-DR的表達情況；用噻唑藍(MTT)法檢測混合

4、淋巴細胞試驗(MLR)中DC細胞對T細胞的促增殖作用；用ELASA法檢測培養(yǎng)上清中IL-12的分泌量。 第二部分口腔癌患者外周血來源的樹突狀細胞體外負載抗原后抑瘤作用的實驗研究 無菌采集20例口腔癌患者(臨床Ⅰ、Ⅱ期)和20例健康志愿者外周血50ml(肝素鈉抗凝)，分離單個核細胞體外誘導培養(yǎng)DC，并將實驗組和對照組細胞(DC)各分為三組，A組為未處理組，B組為凍融組，C組為RNA轉染組。A組DC在培養(yǎng)5d后，每孔加入TN

5、F-α 200U/ml(終濃度)；B組DC培養(yǎng)第5d后，每孔中加入癌細胞蛋白抗原，使DC/腫瘤細胞=1：1，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，每孔加入TNF-α200U/ml(終濃度)；C組．將培養(yǎng)至第5d的未成熟DC用腫瘤細胞RNA進行轉染(DC：RNA=1×10<'5>/ml：5ug，按照invitrogen DMRIE-C試劑說明書進行操作)，轉染結束后用完全培基取代轉染劑，每孔加入TNF-α200U/ml(終濃度)。各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)至第7d，用流

6、式細胞儀檢測細胞表面分予的表達。將非貼壁細胞用含終濃度為200U/mlIL-2的RPMII640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)7d時，將上述細胞分別與各組DC以10：1的比例混合，培養(yǎng)7d后再用各組DCs刺激一次，繼續(xù)培養(yǎng)一周后，收集CTL細胞，以異體卵巢癌細胞作對照，用LDH法(乳酸脫氫酶殺傷試驗)檢測CTL對口腔癌細胞的特異性殺傷活性，并用ELISA法檢測各組CTL培養(yǎng)上清中Th1型細胞因子如IFN-γ的分泌量。 第三部分樹突狀細胞介導的體

7、內抑瘤作用和特異性免疫應答的實驗研究 建立舌癌細胞(Tca-83)裸鼠荷瘤模型，每兩天用游標卡尺測量并且記錄腫瘤縱徑(a)、橫徑(b)，按體積(V)=7cab2/6計算腫瘤體積。選取24只裸鼠隨機分成4組，其中A組6只為陰性對照組，只在皮下注射生理鹽水；B組為未處理DC激活的CTL組，在腫瘤長出一周時于皮下注射(4×10<'7>/0．2ml)只，同時注射IL-2 1000U/只；C組為負載腫瘤抗原的CTL組，在腫瘤長出一周時于小

8、鼠皮下注射(4×10<'7>/0．2ml)只，同時注射IL-2 1000U/只，第二周時重復注射一次； D組為RNA轉染的CTL組，注射方法及細胞數(shù)同C組。對以上各組荷瘤裸鼠每兩天觀察腫瘤生長情況，繪制腫瘤生長曲線，計算抑瘤率。于接種腫瘤5周后，脫頸椎處死裸鼠，檢測腫瘤組織細胞周期的改變和細胞凋亡情況，測定荷瘤鼠體內外周血中CD4<'+>和CD8<'+>T細胞表型變化。 結果 第一部分 1．口腔癌患者外周血單個核

9、細胞誘導培養(yǎng)24h后，可見貼壁單核細胞聚集成大小不等的細胞聚體，第3d可見細胞聚集成團，少量懸浮生長，部分細胞體積增大。第5 d，懸浮細胞數(shù)量增多，細胞表面有細小突起形成。第7d懸浮細胞或細胞團顏色變深，有明顯樹突狀突起，直至第14d均為此典型形態(tài)，其中A組DC細胞表面突起少，胞漿內空泡狀明顯。 2.口腔癌患者外周血單個核細胞誘導培養(yǎng)第5d、第7d、第10d、第14d時，細胞表面DC分子的表達情況。 3.不同抗原負載方式

10、對DC細胞表型CD83、CD1a、HLA-DR、CD86和CD80的表達率的影響無顯著性差異(P>0.05)。 4.MLR結果表明，各組DC對T細胞有不同程度的刺激作用，而且隨DC比例的增加而逐漸增強；抗原負載后的DC對T細胞的激發(fā)和增殖作用均強于未負載組，且C<,2>(健康人RNA轉染組)>B<,2>(健康人負載腫瘤抗原組)、C<,1>(患者RNA轉染組)>B<,1>(患者負載腫瘤抗原組)(P<0.05)。3.LDH殺傷實驗結

11、果顯示：效靶比高者殺傷率大，而且負載腫瘤抗原組CTL殺傷率高于未負載組，其中C<,2>>B<,2>、C<,1>>B<,1>(P<0.01)。 5.抗原負載后，Th1型細胞因子如IFN-γ分泌量顯著增加。在未負載抗原前，A<,1>組(健康人未處理組)和A<,2>組(患者未處理組)IFN-γ分泌量很低，分別為60±8.9pg/ml、140+27pg/ml，用不同方式負載抗原后，IFN-γ的分泌水平顯著上升，且C<,1>>B<,1>、

12、C<,2>>B<,2>組(P<0.05)。 第二部分 1.將Tca-83細胞接種于24只裸鼠后，10～14天均長出腫瘤，瘤體初期生長緩慢，后期生長加快，質地堅硬，表面光滑，與周圍組織無粘連。摘除的實體瘤經(jīng)病理學鑒定，確認為Tca-83細胞移植瘤。 2.接種腫瘤細胞后第二周對荷瘤小鼠進行第一次細胞治療，此時，4組裸鼠體內腫瘤大小分別為0.030±0.014cm<'3>0.035±0.019cm<'3>，0.032±

13、0.017 cm<'3>及0.037±23cm<'3>，差異無顯著性(P>0.05)。接受治療后，A組(生理鹽水組)裸鼠腫瘤持續(xù)增長，荷瘤鼠出現(xiàn)形體消瘦；B組(未處理DC誘導的CTL)小鼠5天內腫瘤體積縮小，但一周左右腫瘤則再度生長，至處死時裸鼠體內腫瘤的大小與未治療組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；C組(負載腫瘤抗原DC誘導的CTL)、D組(腫瘤RNA轉染DC誘導的CTL)腫瘤生長緩慢，至處死時兩組腫瘤大小與A、B組相比有明顯差異(

14、P<0.01)，D組CTL抑瘤效果優(yōu)于C組。 3.與A組相比，B、C、D組移植瘤細胞(G0/G1期細胞比率顯著增多(P<0.01)，S期細胞比率無顯著變化(P>0.05)，而(G2/M期細胞比率和PI值顯著降低(P<0.05)，且B、C、D三組之間均有顯著性差異(P<0.05)；從DNA直方圖上可以看出，A組細胞無凋亡現(xiàn)象，而B、C、D組瘤細胞的凋亡率顯著增加(P<0.01)。 4.與A組相比，B、C、D組荷瘤鼠外周血中

15、CD4<'+>、CD8<'+>T細胞比例均顯著升高(P<0.01)，CD組CD4<'+>T細胞標記率下降，CD8<'+>T細胞標記率上升，與B組相比差異顯著(P<0.05)。 結論： 1．應用GM-CSF、IL-4和HTNF-α三種細胞因子聯(lián)合可成功誘導口腔癌患者外周血單個核細胞體外擴增為DC并向成熟型轉化，但在DC成熟后，CD80、CD86等共刺激分子表達率差異顯著，該現(xiàn)象與腫瘤的臨床分期、腫瘤的大小、腫瘤的分化程度及

16、有無淋巴結轉移有關，與患者的年齡、性別和病理類型無關。 2．口腔癌患者的DC存在免疫功能缺陷，即使經(jīng)TNF-α誘導，也不能使非成熟狀態(tài)的DC進展為完全成熟狀態(tài)，該DC刺激同種異體T細胞增殖的能力較低，IL-12的分泌量少，經(jīng)自體腫瘤RNA或腫瘤裂解物處理后，免疫原性仍較差，因此需要一些細胞因子或佐劑的刺激，以提高殺傷活性。 3．用腫瘤裂解物負載和經(jīng)RNA轉染加載腫瘤抗原方式，均可以促進口腔癌患者外周血中DC的成熟，使其表

17、面分子和共刺激分子等表達上調，可達正常人水平(P>0.05)。經(jīng)自體腫瘤抗原RNA轉染后的DC，其腫瘤殺傷活性及特異性強于負載腫瘤裂解物的DC，但患者組的殺傷率仍低于正常人組。 4．負載腫瘤抗原的DC誘導產(chǎn)生的CTL可以有效控制荷瘤鼠體內口腔癌細胞的生長，其中RNA轉染組DC的特異性殺傷活性高于腫瘤裂解物負載組。負載腫瘤抗原DC所介導的CTL特異性殺傷作用的機制之一是改變移植瘤細胞的細胞周期，誘導腫瘤細胞凋亡。 5．DC