殼寡糖生物微膠囊的制備、代謝及應(yīng)用研究.pdf

1、本博士論文《殼寡糖生物微膠囊的制備、代謝及應(yīng)用的研究》選用天然材料殼寡糖為囊材制作載藥納米膠囊,發(fā)展了三種殼寡糖載藥納米顆粒的制備方法,并針對(duì)臨床急需,將顆粒用于小鼠腦白質(zhì)軟化模型的治療,考察了載藥顆粒的治療效果和體內(nèi)代謝過(guò)程；為了揭示載藥顆粒的作用機(jī)制,本研究從分子生物學(xué)角度出發(fā),開創(chuàng)性地將和頻光譜技術(shù)(SFG)和磷脂雙層膜支撐技術(shù)聯(lián)合使用于納米顆粒的學(xué)習(xí)中,成功地闡述了顆粒滲透進(jìn)入細(xì)胞膜的相關(guān)過(guò)程,揭示了藥物載體與細(xì)胞的相互作用機(jī)理

2、。本論文共分為三個(gè)部分:第一部分,殼寡糖納米微球的制備及性質(zhì)考察；第二部分,殼寡糖納米微球的臨床應(yīng)用；第三部分,殼寡糖納米微球與細(xì)胞作用機(jī)理的研究。
　　 第一部分：殼寡糖納米微球的制備及性質(zhì)考察
　　 本部分通過(guò)分子自組裝原理制備了三種基于殼寡糖的納米顆粒。(a)優(yōu)化了環(huán)己烷/曲拉通-100/正戊醇微乳體系,制備了殼寡糖(CS)/海藻酸鈉(ALG)納米顆粒,通過(guò)考察條件將粒徑控制在170納米。(b)設(shè)計(jì)并優(yōu)化了環(huán)己烷/

3、AOT/正辛醇反向微乳體系并制備了殼寡糖(CS)/羥基磷灰石(HA)納米顆粒,經(jīng)優(yōu)化控制粒徑為173納米；(c)使用凝膠沉淀法制備了粒徑為266納米的殼寡糖(CS)/三聚磷酸鈉(TPP)納米顆粒。對(duì)比三種顆粒的載藥性能,發(fā)現(xiàn)殼寡糖(CS)/海藻酸鈉(ALG)納米顆粒載藥性能優(yōu)越可達(dá)88％,在12到48小時(shí)PBS溶液中載蛋白顆粒的緩釋率維持在35％到40％。而CS/HA顆粒對(duì)BSA的載藥量最高僅能達(dá)到39.7％,三種顆粒均有良好的緩釋性能

4、。通過(guò)生物相容性考察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞與三類顆粒共培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)狀態(tài)良好,而羥基磷灰石顆粒對(duì)軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯促進(jìn)作用?？v觀三類殼寡糖顆粒,CS/TPP顆粒在全水環(huán)境下制備,體系純凈,化學(xué)物質(zhì)干擾少,生物相容性好,因此后續(xù)研究選擇CS/TPP顆粒。
　　 第二部分：殼寡糖(CS)/三聚磷酸鈉(TPP)納米顆粒的臨床應(yīng)用:
　　 為了考察顆粒的應(yīng)用性能,本研究首先通過(guò)腦立體定位系統(tǒng)于小鼠腦室胼胝體內(nèi)微創(chuàng)注射3-硝基丙酸(3-NP)化學(xué)

5、毒素,以此方法構(gòu)建了小鼠缺氧缺血腦白質(zhì)損傷(PVL)模型,考察了PVL模型鼠的病理學(xué)狀態(tài),通過(guò)免疫組織化學(xué)染色和神經(jīng)行為學(xué)測(cè)試探討了3-NP誘導(dǎo)腦損傷的機(jī)理和神經(jīng)元細(xì)胞非正常死亡的過(guò)程。研究中蘇木精(HE)染色顯示P6、P7、P8、P9、P14的3-NP組皮質(zhì)下及腦室周圍白質(zhì)出現(xiàn)不同程度疏松及液化灶,P14出現(xiàn)腦室擴(kuò)大,腦室指數(shù)較PBS組高,差異顯著,腦皮質(zhì)無(wú)明顯變化；O4星型細(xì)胞(oligodendrocytes)染色顯示3-NP組陽(yáng)

6、性細(xì)胞較PBS組明顯減少,差異顯著；MBP免疫染色顯示3-NP組平均光密度值較PBS組低,差異具顯著性；神經(jīng)行為學(xué)檢測(cè)顯示3-NP組出現(xiàn)明顯的神經(jīng)行為學(xué)異常,與PBS組比較有明顯差異。除此之外,研究中還利用微透析技術(shù),分別于造模前后15、30、45、60、75和90 min收集透析液,經(jīng)高效液相色譜(HPLC)定量分析透析液中谷氨酸(glutamate,Glu)、天冬氨酸(aspartic acid,Asp)、甘氨酸(glycine,G

7、ly)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)含量,計(jì)算興奮毒性指數(shù)(excitotoxic index,EI)變化。微透析實(shí)驗(yàn)顯示,細(xì)胞外液中Glu與Asp濃度在造模后15～45min升高,明顯高于造模前水平,隨后恢復(fù)到造模前水平；Gly濃度在造模后15～75min顯著升高,90min恢復(fù)至造模前水平；GABA濃度在造模后15～30min時(shí)明顯高于造模前水平,45min后恢復(fù)至造模前水平；反映興奮性神經(jīng)遞質(zhì)與

8、抑制性神經(jīng)遞質(zhì)平衡綜合指數(shù)的EI值在造模后15～75min明顯增高,90min恢復(fù)至造模前水平。結(jié)論:1)3-NPA腦內(nèi)注射誘導(dǎo)P5新生鼠PVL模型符合腦室周圍白質(zhì)軟化的神經(jīng)病理學(xué)及神經(jīng)行為學(xué)特征,可作為相關(guān)疾病研究的可靠模型。2)氨基酸遞質(zhì)在PVL的損傷過(guò)程中出現(xiàn)規(guī)律性變化:無(wú)論是興奮性氨基酸還是抑制性氨基酸在損傷的早期階段都出現(xiàn)顯著增高,隨后恢復(fù)至損傷前的水平；反映興奮性神經(jīng)遞質(zhì)與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)平衡綜合指數(shù)的EI值亦表現(xiàn)出同樣的規(guī)律

9、性。這表明興奮毒性作用在PVL的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用,尤其在早期階段。
　　 通過(guò)以上研究,我們發(fā)現(xiàn)PVL的發(fā)病機(jī)制在于祖元細(xì)胞的非正常死亡,因此本研究認(rèn)為對(duì)PVL干預(yù)措施宜在早期階段進(jìn)行。因此,在模型制作兩小時(shí)內(nèi)本研究通過(guò)腹腔注射載EPO顆粒的方式對(duì)PVL模型鼠進(jìn)行治療。通過(guò)腦切片和病理學(xué)特征的變化我們驗(yàn)證了EPO載藥顆粒對(duì)PVL模型鼠的治療效果,通過(guò)肝腎切片我們考察了載藥顆粒在動(dòng)物肝臟、腎臟中的代謝過(guò)程。結(jié)論:1)3-N

10、P模型經(jīng)EPO干預(yù)后MBP標(biāo)記細(xì)胞增多,表明成熟OL的數(shù)量增加,從而減輕髓鞘形成障礙；2)EPO可以提高GAP-43的表達(dá)水平,促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)修復(fù),改善運(yùn)動(dòng)功能,對(duì)PVL起到遠(yuǎn)期神經(jīng)保護(hù)作用；3)載EPO顆粒在肝腎內(nèi)的代謝周期為72小時(shí),大大延長(zhǎng)了EPO在體內(nèi)的停留時(shí)間；4)50單位活性的EPO緩釋顆粒對(duì)動(dòng)物的治療效果顯著,避免了大劑量使用EPO可能造成的不良后果和反復(fù)注射造成的病人痛苦。因此緩釋納米材料載體可以大大提高EPO對(duì)神經(jīng)元的保

11、護(hù)效能。究其因?yàn)榭赡苁蔷忈尲{米載體可以有效的防止EPO受到血液和體液中各種酶的攻擊,并延長(zhǎng)EPO在體內(nèi)的代謝時(shí)間。但是殼寡糖這類緩釋納米材料提高藥效的機(jī)理依然需要從細(xì)胞生物學(xué)等角度深入研究。
　　 第三部分：納米顆粒與細(xì)胞相互作用的機(jī)理。
　　 普遍認(rèn)為,納米載體延長(zhǎng)了藥物在體內(nèi)的代謝時(shí)間,從而提高了藥效。但多數(shù)藥物載體與細(xì)胞的作用關(guān)系并非如此簡(jiǎn)單。解釋納米藥物載體作用機(jī)理的關(guān)鍵是要了解載體與細(xì)胞的作用關(guān)系機(jī)理。細(xì)胞膜是

12、納米藥物載體與細(xì)胞作用的第一接觸媒介。研究表明,顆粒與細(xì)胞作用的機(jī)制非常復(fù)雜往往與顆粒的很多物理化學(xué)性質(zhì)如親疏水性、顆粒大小、表面電荷等有著密切的關(guān)系。本研究通過(guò)應(yīng)用三種細(xì)胞內(nèi)吞噬阻斷劑作用于細(xì)胞的鉀、鈉離子代謝通道從而控制細(xì)胞對(duì)納米顆粒的內(nèi)吞噬作用,考察了顆粒進(jìn)入細(xì)胞的總體過(guò)程和主要方式。研究發(fā)現(xiàn),在細(xì)胞內(nèi)吞噬通道全閉合的情況下殼聚糖顆?？梢皂樌ㄟ^(guò)細(xì)胞膜,而作為對(duì)照的PS顆粒只有在巨吞噬通路(macropinocytosispath

13、way)的情況下可以進(jìn)入細(xì)胞膜。為了進(jìn)一步考察顆粒與細(xì)胞膜的作用過(guò)程,我們使用人工雙層膜囊泡對(duì)顆粒進(jìn)入囊泡的過(guò)程進(jìn)行了考察,以確定顆粒對(duì)細(xì)胞膜的作用。通過(guò)囊泡內(nèi)染料泄露曲線的變化我們發(fā)現(xiàn)殼寡糖顆粒對(duì)囊泡的破壞作用明顯,但PS顆粒對(duì)人工雙層膜囊泡無(wú)影響。這充分說(shuō)明了殼寡糖納米藥物載體有著與蛋白類似的穿透人工雙層磷脂膜的能力。通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的考察,我們觀察到了顆粒滲透進(jìn)入囊泡后由于膜的流動(dòng)性而發(fā)生的囊泡重新閉合的過(guò)程。為了深入了解納米載體與細(xì)胞

14、膜的作用我們通過(guò)AIR-FTIR聯(lián)合和頻光譜SFG學(xué)習(xí),從殼寡糖生物微膠囊與細(xì)胞的相互作用機(jī)理和體內(nèi)代謝作用機(jī)理,深入探索了殼寡糖納米藥物載體與細(xì)胞膜相互作用的影響。從分子生物學(xué)層面詳細(xì)探討了空白、載藥生物微膠囊與細(xì)胞間的相互作用關(guān)系機(jī)理,并研究了不同種類的生物膠囊與細(xì)胞膜相互作用的過(guò)程,該研究對(duì)于解決很多藥物載體在使用過(guò)程中的實(shí)質(zhì)性問(wèn)題并合理解釋相關(guān)現(xiàn)象至關(guān)重要,不僅對(duì)本課題,甚至對(duì)多糖類新型天然生物材料的基礎(chǔ)性研究意義都非常重大。本

15、研究開創(chuàng)性的使用了“cushion”技術(shù)以克服SFG在研究細(xì)胞膜過(guò)程中存在的無(wú)法模擬真實(shí)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的問(wèn)題。通過(guò)對(duì)“cushion”表面人工細(xì)胞膜的計(jì)算,本論文成功地解決了顆粒研究過(guò)程中人工膜內(nèi)環(huán)境無(wú)法模擬真實(shí)環(huán)境的瓶頸問(wèn)題,并找到了一種性質(zhì)優(yōu)良的cushion模擬細(xì)胞質(zhì)的真實(shí)親水環(huán)境。該項(xiàng)目的研究成果有望解決現(xiàn)階段藥物研究中存在的關(guān)鍵問(wèn)題,并同步實(shí)現(xiàn)生物膠囊的可控釋放、可控降解等瓶頸問(wèn)題,為多種材料的實(shí)際應(yīng)用開創(chuàng)了新的分析方法,為材料的