殼寡糖生物微膠囊的制備、代謝及應用研究.pdf

1、本博士論文《殼寡糖生物微膠囊的制備、代謝及應用的研究》選用天然材料殼寡糖為囊材制作載藥納米膠囊,發(fā)展了三種殼寡糖載藥納米顆粒的制備方法,并針對臨床急需,將顆粒用于小鼠腦白質(zhì)軟化模型的治療,考察了載藥顆粒的治療效果和體內(nèi)代謝過程；為了揭示載藥顆粒的作用機制,本研究從分子生物學角度出發(fā),開創(chuàng)性地將和頻光譜技術(SFG)和磷脂雙層膜支撐技術聯(lián)合使用于納米顆粒的學習中,成功地闡述了顆粒滲透進入細胞膜的相關過程,揭示了藥物載體與細胞的相互作用機理

2、。本論文共分為三個部分:第一部分,殼寡糖納米微球的制備及性質(zhì)考察；第二部分,殼寡糖納米微球的臨床應用；第三部分,殼寡糖納米微球與細胞作用機理的研究。
　　 第一部分：殼寡糖納米微球的制備及性質(zhì)考察
　　 本部分通過分子自組裝原理制備了三種基于殼寡糖的納米顆粒。(a)優(yōu)化了環(huán)己烷/曲拉通-100/正戊醇微乳體系,制備了殼寡糖(CS)/海藻酸鈉(ALG)納米顆粒,通過考察條件將粒徑控制在170納米。(b)設計并優(yōu)化了環(huán)己烷/

3、AOT/正辛醇反向微乳體系并制備了殼寡糖(CS)/羥基磷灰石(HA)納米顆粒,經(jīng)優(yōu)化控制粒徑為173納米；(c)使用凝膠沉淀法制備了粒徑為266納米的殼寡糖(CS)/三聚磷酸鈉(TPP)納米顆粒。對比三種顆粒的載藥性能,發(fā)現(xiàn)殼寡糖(CS)/海藻酸鈉(ALG)納米顆粒載藥性能優(yōu)越可達88％,在12到48小時PBS溶液中載蛋白顆粒的緩釋率維持在35％到40％。而CS/HA顆粒對BSA的載藥量最高僅能達到39.7％,三種顆粒均有良好的緩釋性能

4、。通過生物相容性考察發(fā)現(xiàn)細胞與三類顆粒共培養(yǎng)時生長狀態(tài)良好,而羥基磷灰石顆粒對軟骨細胞的生長有明顯促進作用?？v觀三類殼寡糖顆粒,CS/TPP顆粒在全水環(huán)境下制備,體系純凈,化學物質(zhì)干擾少,生物相容性好,因此后續(xù)研究選擇CS/TPP顆粒。
　　 第二部分：殼寡糖(CS)/三聚磷酸鈉(TPP)納米顆粒的臨床應用:
　　 為了考察顆粒的應用性能,本研究首先通過腦立體定位系統(tǒng)于小鼠腦室胼胝體內(nèi)微創(chuàng)注射3-硝基丙酸(3-NP)化學

5、毒素,以此方法構建了小鼠缺氧缺血腦白質(zhì)損傷(PVL)模型,考察了PVL模型鼠的病理學狀態(tài),通過免疫組織化學染色和神經(jīng)行為學測試探討了3-NP誘導腦損傷的機理和神經(jīng)元細胞非正常死亡的過程。研究中蘇木精(HE)染色顯示P6、P7、P8、P9、P14的3-NP組皮質(zhì)下及腦室周圍白質(zhì)出現(xiàn)不同程度疏松及液化灶,P14出現(xiàn)腦室擴大,腦室指數(shù)較PBS組高,差異顯著,腦皮質(zhì)無明顯變化；O4星型細胞(oligodendrocytes)染色顯示3-NP組陽

6、性細胞較PBS組明顯減少,差異顯著；MBP免疫染色顯示3-NP組平均光密度值較PBS組低,差異具顯著性；神經(jīng)行為學檢測顯示3-NP組出現(xiàn)明顯的神經(jīng)行為學異常,與PBS組比較有明顯差異。除此之外,研究中還利用微透析技術,分別于造模前后15、30、45、60、75和90 min收集透析液,經(jīng)高效液相色譜(HPLC)定量分析透析液中谷氨酸(glutamate,Glu)、天冬氨酸(aspartic acid,Asp)、甘氨酸(glycine,G

7、ly)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)含量,計算興奮毒性指數(shù)(excitotoxic index,EI)變化。微透析實驗顯示,細胞外液中Glu與Asp濃度在造模后15～45min升高,明顯高于造模前水平,隨后恢復到造模前水平；Gly濃度在造模后15～75min顯著升高,90min恢復至造模前水平；GABA濃度在造模后15～30min時明顯高于造模前水平,45min后恢復至造模前水平；反映興奮性神經(jīng)遞質(zhì)與

8、抑制性神經(jīng)遞質(zhì)平衡綜合指數(shù)的EI值在造模后15～75min明顯增高,90min恢復至造模前水平。結論:1)3-NPA腦內(nèi)注射誘導P5新生鼠PVL模型符合腦室周圍白質(zhì)軟化的神經(jīng)病理學及神經(jīng)行為學特征,可作為相關疾病研究的可靠模型。2)氨基酸遞質(zhì)在PVL的損傷過程中出現(xiàn)規(guī)律性變化:無論是興奮性氨基酸還是抑制性氨基酸在損傷的早期階段都出現(xiàn)顯著增高,隨后恢復至損傷前的水平；反映興奮性神經(jīng)遞質(zhì)與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)平衡綜合指數(shù)的EI值亦表現(xiàn)出同樣的規(guī)律

9、性。這表明興奮毒性作用在PVL的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用,尤其在早期階段。
　　 通過以上研究,我們發(fā)現(xiàn)PVL的發(fā)病機制在于祖元細胞的非正常死亡,因此本研究認為對PVL干預措施宜在早期階段進行。因此,在模型制作兩小時內(nèi)本研究通過腹腔注射載EPO顆粒的方式對PVL模型鼠進行治療。通過腦切片和病理學特征的變化我們驗證了EPO載藥顆粒對PVL模型鼠的治療效果,通過肝腎切片我們考察了載藥顆粒在動物肝臟、腎臟中的代謝過程。結論:1)3-N

10、P模型經(jīng)EPO干預后MBP標記細胞增多,表明成熟OL的數(shù)量增加,從而減輕髓鞘形成障礙；2)EPO可以提高GAP-43的表達水平,促進神經(jīng)生長修復,改善運動功能,對PVL起到遠期神經(jīng)保護作用；3)載EPO顆粒在肝腎內(nèi)的代謝周期為72小時,大大延長了EPO在體內(nèi)的停留時間；4)50單位活性的EPO緩釋顆粒對動物的治療效果顯著,避免了大劑量使用EPO可能造成的不良后果和反復注射造成的病人痛苦。因此緩釋納米材料載體可以大大提高EPO對神經(jīng)元的保

11、護效能。究其因為可能是緩釋納米載體可以有效的防止EPO受到血液和體液中各種酶的攻擊,并延長EPO在體內(nèi)的代謝時間。但是殼寡糖這類緩釋納米材料提高藥效的機理依然需要從細胞生物學等角度深入研究。
　　 第三部分：納米顆粒與細胞相互作用的機理。
　　 普遍認為,納米載體延長了藥物在體內(nèi)的代謝時間,從而提高了藥效。但多數(shù)藥物載體與細胞的作用關系并非如此簡單。解釋納米藥物載體作用機理的關鍵是要了解載體與細胞的作用關系機理。細胞膜是

12、納米藥物載體與細胞作用的第一接觸媒介。研究表明,顆粒與細胞作用的機制非常復雜往往與顆粒的很多物理化學性質(zhì)如親疏水性、顆粒大小、表面電荷等有著密切的關系。本研究通過應用三種細胞內(nèi)吞噬阻斷劑作用于細胞的鉀、鈉離子代謝通道從而控制細胞對納米顆粒的內(nèi)吞噬作用,考察了顆粒進入細胞的總體過程和主要方式。研究發(fā)現(xiàn),在細胞內(nèi)吞噬通道全閉合的情況下殼聚糖顆?？梢皂樌ㄟ^細胞膜,而作為對照的PS顆粒只有在巨吞噬通路(macropinocytosispath

13、way)的情況下可以進入細胞膜。為了進一步考察顆粒與細胞膜的作用過程,我們使用人工雙層膜囊泡對顆粒進入囊泡的過程進行了考察,以確定顆粒對細胞膜的作用。通過囊泡內(nèi)染料泄露曲線的變化我們發(fā)現(xiàn)殼寡糖顆粒對囊泡的破壞作用明顯,但PS顆粒對人工雙層膜囊泡無影響。這充分說明了殼寡糖納米藥物載體有著與蛋白類似的穿透人工雙層磷脂膜的能力。通過長時間的考察,我們觀察到了顆粒滲透進入囊泡后由于膜的流動性而發(fā)生的囊泡重新閉合的過程。為了深入了解納米載體與細胞

14、膜的作用我們通過AIR-FTIR聯(lián)合和頻光譜SFG學習,從殼寡糖生物微膠囊與細胞的相互作用機理和體內(nèi)代謝作用機理,深入探索了殼寡糖納米藥物載體與細胞膜相互作用的影響。從分子生物學層面詳細探討了空白、載藥生物微膠囊與細胞間的相互作用關系機理,并研究了不同種類的生物膠囊與細胞膜相互作用的過程,該研究對于解決很多藥物載體在使用過程中的實質(zhì)性問題并合理解釋相關現(xiàn)象至關重要,不僅對本課題,甚至對多糖類新型天然生物材料的基礎性研究意義都非常重大。本

15、研究開創(chuàng)性的使用了“cushion”技術以克服SFG在研究細胞膜過程中存在的無法模擬真實細胞內(nèi)環(huán)境的問題。通過對“cushion”表面人工細胞膜的計算,本論文成功地解決了顆粒研究過程中人工膜內(nèi)環(huán)境無法模擬真實環(huán)境的瓶頸問題,并找到了一種性質(zhì)優(yōu)良的cushion模擬細胞質(zhì)的真實親水環(huán)境。該項目的研究成果有望解決現(xiàn)階段藥物研究中存在的關鍵問題,并同步實現(xiàn)生物膠囊的可控釋放、可控降解等瓶頸問題,為多種材料的實際應用開創(chuàng)了新的分析方法,為材料的