雙酚A影響大鼠雄性子代腦多巴胺神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和功能的機(jī)理研究.pdf

1、目的： 多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)行為檢測結(jié)果表明，腦發(fā)育期暴露于雙酚A可影響與腦多巴胺系統(tǒng)有關(guān)的行為如多動(dòng)癥等，而導(dǎo)致這些行為改變的機(jī)理目前還不清楚。本研究分別采用原代培養(yǎng)的胎鼠腦多巴胺神經(jīng)元和圍生期雙酚A暴露的動(dòng)物模型，從基因、細(xì)胞和整體動(dòng)物水平探討雙酚A影響大鼠雄性子代腦多巴胺神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和功能的機(jī)理。 方法： 第一部分體外實(shí)驗(yàn)：用原代培養(yǎng)的胎鼠腦多巴胺神經(jīng)元探討雙酚A對神經(jīng)細(xì)胞的損傷機(jī)制。 1．建立胎鼠腦多巴胺

2、神經(jīng)元無血清體外培養(yǎng)模型：取孕14-15天SD大鼠的胎仔，以DMEM／F1.2含血清培養(yǎng)基接種，體外培養(yǎng)1天后換為Neurobasal+B27的無血清培養(yǎng)基，以后隔日換液。分別于體外培養(yǎng)第4天和第7天時(shí)用GFAP、NSE、TH免疫組化鑒定細(xì)胞類型、神經(jīng)細(xì)胞純度和其中多巴胺神經(jīng)元的比例；經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)后使操作過程、培養(yǎng)條件和多巴胺神經(jīng)元的比例達(dá)到穩(wěn)定。 2．用MTT試驗(yàn)探討雙酚A對神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用和確定進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)采用的劑量范圍；

3、 3．雙酚A對神經(jīng)細(xì)胞的氧化損傷作用檢測：細(xì)胞于體外分別培養(yǎng)4天和7天后，分別加入0，1，10，25，50，100μM雙酚A，繼續(xù)培養(yǎng)24h和48h后，采用細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測的分子探針(DCFH-DA)檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧，用SOD、GSH和MDA試劑盒檢測細(xì)胞抗氧化酶和脂質(zhì)過氧化物水平。 4．檢測雙酚A對神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響和對多巴胺神經(jīng)元的特異損傷作用：用彗星實(shí)驗(yàn)定性檢測、流式細(xì)胞儀定量檢測雙酚A引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡；用酪氨酸羥化

4、酶免疫組化方法計(jì)數(shù)不同劑量雙酚A作用下的多巴胺神經(jīng)元比例的變化。 第二部分體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：圍生期雙酚A暴露對出生后雄性子代大鼠腦多巴胺神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育影響的研究。 SD孕鼠自E10天至出生后21天(PND21)仔鼠斷乳止每日對母鼠灌胃染毒，分為50mg、5mg、0.5mgBPA／kg·BW劑量組及對照組。分別進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)： 1．每日定時(shí)觀察記錄各組母鼠在仔鼠出生后早期(PNDO至開眼時(shí)PNDl5)期間對仔鼠的看護(hù)及哺乳情況

5、，記錄子代雄鼠的生長發(fā)育一般狀況；并分別于仔鼠出生后第5、15、21、30和45天取雄性仔鼠腦，矢狀面一分為二，一半進(jìn)行組織病理固定，另一半于液氮中保存?zhèn)溆谩?2．上述標(biāo)本中取15、21、30和45天的樣品進(jìn)行HE染色，于光鏡下觀察雄性仔鼠中腦區(qū)的常規(guī)組織病理學(xué)改變； 3．取第5、15、21、30和45天標(biāo)本，采用免疫組化檢測雙酚A暴露對雄性子鼠腹側(cè)中腦區(qū)與凋亡有關(guān)的caspase-3、bcl-2蛋白表達(dá)的影響，用TUN

6、EL檢測出生后21天和30天雄鼠腹側(cè)中腦區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。 4．取第5、15、21、30和45天取雄性仔鼠腦，免疫組化檢測雙酚A暴露對腹側(cè)中腦區(qū)Nurrl和TH蛋白表達(dá)的影響。 5．采用熒光定量RT-PCR方法檢測雙酚A暴露對出生后21天、30天的雄性子鼠腦Nurrl、TH及DAT mRNA表達(dá)的影響。 結(jié)果： 一、體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1．原代培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基內(nèi)生長狀態(tài)良好，細(xì)胞逐漸長大、伸

7、出突觸并逐漸相互連結(jié)成網(wǎng)絡(luò)，10天以內(nèi)細(xì)胞處于生長旺盛期并逐漸成熟，細(xì)胞間網(wǎng)絡(luò)連接增加，此后細(xì)胞生長狀況逐漸穩(wěn)定。細(xì)胞在體外存活時(shí)間可達(dá)30天以上。分別于體外培養(yǎng)4或7天后經(jīng)免疫組化鑒定其中TH<'+>(多巴胺神經(jīng)元)細(xì)胞比例可達(dá)到3～5％左右，而且神經(jīng)細(xì)胞占其中的絕大多數(shù)，膠質(zhì)細(xì)胞的比例僅在1～2％左右，達(dá)到以往相關(guān)文獻(xiàn)中細(xì)胞的培養(yǎng)條件，表明可以用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)； 2．MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雙酚A在10<'-8>M(1pM)至1

8、0μM以下時(shí)對神經(jīng)細(xì)胞活性基本沒有影響，在25μM時(shí)細(xì)胞存活開始出現(xiàn)明顯降低，25μM～400～μM之間細(xì)胞存活率隨雙酚A濃度增加而降低，呈現(xiàn)劑量反應(yīng)關(guān)系。因此確定采用1～100μM劑量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)； 3．細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測結(jié)果表明，在1～100μM范圍內(nèi)，雙酚A可使體外培養(yǎng)第4d和第7d的細(xì)胞內(nèi)活性氧水平隨劑量增加而顯著升高，25μM以上時(shí)可使細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶SOD、GSH水平降低，使脂質(zhì)過氧化物MDA水平顯著增加； 4．

9、彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明雙酚A在25，50和100μM時(shí)可使細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明DIV4時(shí)雙酚A濃度在25μM以上時(shí)可使細(xì)胞凋亡明顯增加，呈現(xiàn)劑量反應(yīng)關(guān)系；酪氨酸羥化酶免疫組化結(jié)果顯示，雙酚A在10μM以上時(shí)就可使17-1<'+>細(xì)胞比例明顯降低，表明多巴胺神經(jīng)元對雙酚A的毒性作用更敏感。 體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明雙酚A能使細(xì)胞內(nèi)活性氧明顯增加，抗氧化能力顯著降低，主要通過氧化應(yīng)激損傷神經(jīng)細(xì)胞，且多巴胺神經(jīng)元對雙酚A的氧化損

10、傷作用更敏感。 二、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1．可定性觀察到暴露于中(5mg/kg.BW)、高劑量組(50mg／kg.BW)雙酚A的母鼠對出生后早期的仔鼠照看行為改變，表現(xiàn)為哺乳減少，出巢時(shí)間延長。 2．組織病理學(xué)檢測結(jié)果表明，在仔鼠出生后30d(PNDl5，21，30)內(nèi)，中、高劑量組雄性仔鼠腹側(cè)中腦區(qū)存在較多胞體呈圓形，胞核深染，胞質(zhì)濃縮的異常細(xì)胞，并可見該區(qū)域細(xì)胞排列疏松，細(xì)胞數(shù)減少； 3．免疫組化結(jié)果顯示

11、在仔鼠出生后5～30天(PND5，15，21，30)時(shí)，高、中劑量組雄鼠腦腹側(cè)中腦區(qū)caspase-3表達(dá)與對照組相比均顯著增加，bcl-2表達(dá)均顯著降低，低劑量組和對照組相比無顯著差異，出生后45天時(shí)，各組間無顯著差異。TUNEL檢測結(jié)果顯示，在PND21和PND30時(shí)的子代雄鼠腦的同一區(qū)域，中、高劑量組凋亡細(xì)胞明顯增加。 4．TH和Nurrl免疫組化結(jié)果顯示在出生后5-45天(PND5，15，21，30，45)時(shí)，高、中劑量

12、組雄鼠腦腹側(cè)中腦區(qū)TH和Nurrl表達(dá)與對照組相比均顯著降低。TH表達(dá)降低表明BPA暴露使子代腹側(cè)中腦區(qū)多巴胺神經(jīng)元減少。 5．熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，在高、中劑量染毒組，出生后21，30天的雄鼠腦Nurr1、TH和DAT mRNA表達(dá)與對照組相比均顯著降低。 結(jié)論： 1．雙酚A可通過活性氧產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷體外培養(yǎng)的多巴胺神經(jīng)元，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡； 2．圍生期雙酚A暴露可通過caspase-3途徑導(dǎo)致子

13、代雄鼠中腦區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡增加，同時(shí)使中腦區(qū)酪氨酸羥化酶表達(dá)降低，即圍生期雙酚A暴露可造成中腦多巴胺神經(jīng)元減少，從而可使多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)合成減少； 3．圍生期雙酚A暴露可降低與多巴胺神經(jīng)元發(fā)育和功能維持的重要基因Nurrl及其蛋白的表達(dá)降低，同時(shí)也使TH和DAT基因表達(dá)降低。由于這三種基因都是維持多巴胺神經(jīng)元功能的重要基因，它們表達(dá)的改變必然會(huì)引起子代與多巴胺系統(tǒng)有關(guān)的行為改變。 綜合體外和體內(nèi)的研究結(jié)果表明，子代雄鼠腦發(fā)育