攜抗基質(zhì)金屬蛋白酶-9抗體脂質(zhì)微泡在評(píng)價(jià)兔睪丸缺血-再灌注損傷中的研究.pdf

1、目的：探討基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）在兔睪丸中度缺血/再灌注損傷中（IRI）的變化，研制一種具有靶向結(jié)合能力的新型脂質(zhì)微泡，評(píng)價(jià)靶向微泡在兔睪丸中度缺血/再灌注損傷中的價(jià)值。
　　方法：第一部分：12只成年健康大白兔隨機(jī)分成：對(duì)照組（假手術(shù)組/S組），中度缺血再灌注組（IRI組），每組6只。S組隨機(jī)暴露一側(cè)精索，6h后取暴露側(cè)睪丸，福爾馬林固定24h后行HE及免疫組化染色。IRI組隨機(jī)選擇一側(cè)睪丸進(jìn)行扭轉(zhuǎn)手術(shù)，將術(shù)側(cè)睪丸完全

2、阻斷4h后解除結(jié)扎，再灌注2 h后取術(shù)側(cè)睪丸，福爾馬林固定24h后行HE及免疫組化染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察MMP-9在睪丸中的分布，采用image-proplus6.0 Ver圖像處理系統(tǒng)半定量分析MMP-9的平均光密度。
　　第二部分：制備普通脂質(zhì)微泡和靶向脂質(zhì)微泡將各種相關(guān)脂質(zhì)材料按一定比例溶解于適量蒸餾水中，交替使用60℃水浴和超聲波振蕩至分散完全，通六氟化硫（SF6）氣體，機(jī)械振蕩至形成乳白色液體即制備好普通脂質(zhì)微泡或生物

3、素化脂質(zhì)微泡。生物素化脂質(zhì)微泡冰上靜置棄下清液純化后，按一定比例加入親和素，繼續(xù)冰上靜置，棄下清液純化后，按一定比例加入生物素化的抗 MMP-9抗體，冰箱4℃保存?zhèn)溆谩２捎醚?xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)量普通微泡和靶向微泡的粒徑及濃度。采用 FITC標(biāo)記的二抗與攜 MMP-9抗體微泡結(jié)合，熒光顯微鏡下觀察抗 MMP-9抗體與微泡的連接情況。
　　第三部分：18只健康大白兔隨機(jī)分成3組：對(duì)照組（假手術(shù)組/S組）、中度缺血再灌注未爆破組（IRI-1組

4、）、中度缺血再灌組爆破組（IRI-2組），每組6只。S組隨機(jī)暴露一側(cè)精索，6h后行普通脂質(zhì)微泡（MB）和攜抗基質(zhì)金屬蛋白酶-9抗體脂質(zhì)微泡（TMB9）的雙側(cè)睪丸造影。IRI-1組隨機(jī)選擇一側(cè)睪丸進(jìn)行扭轉(zhuǎn)手術(shù)，將術(shù)側(cè)睪丸完全阻斷4h，再灌注2h后行MB和 TMB9的雙側(cè)睪丸造影，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死實(shí)驗(yàn)兔，取術(shù)側(cè)睪丸，福爾馬林固定24h后行HE染色和免疫組化染色。IRI-2組隨機(jī)選擇一側(cè)睪丸進(jìn)行扭轉(zhuǎn)手術(shù)，將術(shù)側(cè)睪丸完全阻斷4 h，再灌注2h后，

5、首先經(jīng)耳緣靜脈團(tuán)注M B，結(jié)合高頻高能量超聲觸發(fā)顯像增強(qiáng)微血管通透性，20min后睪丸行TMB9造影。記錄缺血再灌注睪丸及正常睪丸顯影圖像，全部聲學(xué)造影圖像存于機(jī)內(nèi)，以備脫機(jī)分析。采用專業(yè)超聲軟件分析造影圖像，評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)兔睪丸顯影的曲率（S lope）、達(dá)峰時(shí)間(Tp）、峰值強(qiáng)度（PI）、降半時(shí)間（DT/2）、平均渡越時(shí)間（MTT）及曲線下面積（AUC）。同時(shí)在光學(xué)顯微鏡下觀察IRI-1組的MMP-9在睪丸中的分布，采用image-pro

6、plus6.0 Ver圖像處理系統(tǒng)半定量分析MMP-9的平均光密度。使用 SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均以χ±s表示，組間數(shù)據(jù)的兩兩比較采用單因素方差分析，差異性檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)為p<0.05。
　　結(jié)果：第一部分對(duì)照組睪丸光學(xué)顯微鏡下HE染色顯示睪丸大部分血管及生精小管基膜完整，各級(jí)生精細(xì)胞排列整齊有序，精子數(shù)目眾多，間質(zhì)無(wú)明顯充血、水腫，未見明顯中性粒細(xì)胞。免疫組化結(jié)果示血管內(nèi)、血管基膜及睪丸間質(zhì)均未見明顯基質(zhì)金屬蛋

7、白酶-9表達(dá)。IRI組睪丸光學(xué)顯微鏡下H E染色顯示睪丸組織大部分生精小管基膜及血管的不完整，部分生精上皮層次減少，成熟分化障礙，部分管腔被大量壞死脫落的細(xì)胞充填，間質(zhì)可見明顯充血及白細(xì)胞浸潤(rùn)，免疫組化示血管基底膜及間質(zhì)可見明顯的MMP-9表達(dá)。術(shù)側(cè)MMP-9平均光密度值為0.124±0.034。
　　第二部分 MB及TM B9肉眼觀外觀呈白色懸濁液，光學(xué)顯微鏡下均呈圓形，完整，分布均勻，粒徑約1.5mm~4mm，微泡濃度均約4.

8、8×108個(gè)/ml，熒光顯微鏡下MB未見明顯熒光，TMB9可見明顯綠色熒光圍繞。
　　第三部分對(duì)照組MB與TMB9超聲造影均表現(xiàn)為睪丸包膜下先增強(qiáng)，接著睪丸實(shí)質(zhì)開始均勻的增強(qiáng)，達(dá)到峰值強(qiáng)度后，再緩慢消退，雙側(cè)睪丸超聲造影時(shí)間-強(qiáng)度曲線基本一致，MB組的造影參數(shù)（Slope、TP、PI、DT/2、MTT及AUC）較TM B9組無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；IRI-1組的M B組和 TM B9組的睪丸超聲造影均表現(xiàn)為術(shù)側(cè)睪丸實(shí)質(zhì)較

9、正常側(cè)增強(qiáng)速度更快，迅速達(dá)到峰值強(qiáng)度，且強(qiáng)度顯著增高，再緩慢消退，術(shù)側(cè)時(shí)間-強(qiáng)度曲線較健側(cè)峰值明顯升高、前移且下降延遲，呈現(xiàn)“快進(jìn)慢退”現(xiàn)象，術(shù)側(cè)睪丸造影時(shí)間-強(qiáng)度曲線顯示TM B9組較MB組的達(dá)峰時(shí)間前移，峰值升高、下降延遲且平均造影時(shí)間長(zhǎng)，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。IRI-2組術(shù)側(cè)睪丸TMB9造影表現(xiàn)與IRI-1組類似，兩組造影參數(shù)差別無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。IRI-1組術(shù)側(cè)睪丸的MMP-9平均光密度值為0.080±

10、0.014，較TMB9造影前睪丸的MMP-9平均光密度值差別有計(jì)學(xué)意義（P<0.05）.
　　結(jié)論：1、兔睪丸中度IRI時(shí)睪丸血管基底膜及間質(zhì)可見明顯的MMP-9表達(dá)，而正常兔睪丸血管基底膜及間質(zhì)未見明顯MMP-9的表達(dá)；2、成功制備了普通脂質(zhì)微泡、生物素化脂質(zhì)微泡和攜抗MMP-9單抗靶向超聲微泡；3、與MB組相比， TMB9組在中度IRI的睪丸中滯留時(shí)間長(zhǎng)、濃度高；4、當(dāng)微泡被高能量超聲破壞時(shí)，其瞬時(shí)所產(chǎn)生的“聲空化”效應(yīng)并不能