對(duì)氧磷酶-,1-55 Met-Leu、對(duì)氧磷酶-,2-148 Ala-Gly和錳超氧化物歧化酶9Ala-Val基因多態(tài)性與冠心病的關(guān)系研究.pdf

1、研究目的：冠心病(CAD)是發(fā)達(dá)國(guó)家的主要致死原因，越來(lái)越多的證據(jù)表明遺傳因素在CAD的發(fā)病中起著重要的獨(dú)立作用。對(duì)氧磷酶(paraoxonase，PON)是結(jié)合在高密度脂蛋白(HDL)上的一種有機(jī)磷三酯化合物水解酶，最近研究表明，PON可以防止低密度脂蛋白(LDL)氧化，其活性與基因多態(tài)性被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化(AS)和CAD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。研究發(fā)現(xiàn)AS病人和試驗(yàn)誘發(fā)的AS動(dòng)物的血漿和動(dòng)脈的脂質(zhì)過(guò)氧化物增加，當(dāng)氧化應(yīng)激狀態(tài)升高時(shí)可引起血

2、管發(fā)生炎癥性改變、內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能紊亂。氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)對(duì)內(nèi)皮有很高的細(xì)胞毒性，能促進(jìn)巨嗜細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯聚集，并轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞，繼而導(dǎo)致脂質(zhì)斑塊的形成。錳超氧化物歧化酶(MnSOD)是清除體內(nèi)超氧自由基的特異酶，通過(guò)清除自由基以保護(hù)生物系統(tǒng)免受氧化損傷的危害。MnSOD9Ala/Val基因多態(tài)性改變了未成熟蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和線粒體靶向酶，含有Val等位基因的未成熟蛋白不能有效地靶向作用于線粒體，細(xì)胞的抗氧化平衡被破壞。

3、 PON基因多態(tài)性與冠心病的關(guān)系尚不明確，國(guó)內(nèi)外對(duì)PON155Met/Leu基因多態(tài)性與冠心病關(guān)系的研究較少，對(duì)PON2148Ala/Gly多態(tài)性與冠心病關(guān)系的研究則更少；目前尚未見(jiàn)有關(guān)MnSOD9Ala/Val基因多態(tài)性與CAD關(guān)系的研究。因此本研究擬通過(guò)檢測(cè)CAD和健康對(duì)照組的PON155Met/Leu、PON2148Ala/Gly和MnSOD9Ala/Val基因多態(tài)性基因型、測(cè)定血漿總超氧化物歧化酶(T-SOD)、錳超氧化物

4、歧化酶(MnSOD)、PON活性和丙二醛(MDA)濃度，探討這些基因多態(tài)性與CAD和上述指標(biāo)之間的關(guān)系，期望能為冠心病的基因診斷、疾病預(yù)防和今后的基因治療提供一定的參考依據(jù)。 研究對(duì)象與方法： 一、研究對(duì)象：161例冠心病患者，男82例，女79例；年齡38～92(66.40±10.18)歲；100例年齡、性別匹配的健康人作為對(duì)照組，男53例，女47例，年齡51～86(66.64±6.41)歲。 二、研究方法：

5、 1.DNA提取方法：應(yīng)用上海生工生物工程有限公司生產(chǎn)的UNIQ-10柱式臨床樣品基因組抽提試劑盒(SK1342)，按其說(shuō)明書(shū)介紹的方法提取基因組DNA。 2.PCR反應(yīng)：采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法測(cè)定。用于PCR擴(kuò)增的引物由上海生工公司合成。PON155Met/Leu基因多態(tài)性和PON2148Ala/Gly基因多態(tài)性采用上海生工生物工程有限公司生產(chǎn)的即用PCR試劑盒在25μlPCR反應(yīng)體

6、系中進(jìn)行基因組DNA擴(kuò)增；MnSOD9Ala/Val基因多態(tài)性采用大連寶生物工程有限公司生產(chǎn)的TaKaRaPCRAmplificationKitPCR試劑盒在25μlPCR反應(yīng)體系中進(jìn)行基因組DNA擴(kuò)增。 3.酶切方法：PCR反應(yīng)完成后，分別在20μl總反應(yīng)體系中加入PON155基因產(chǎn)物和Hsp92Ⅱ內(nèi)切酶(10U·μl-1，Promega，USA)，PON2148基因產(chǎn)物和Fnu4HI內(nèi)切酶(10U·μl-1，NewEngla

7、ndBioLabs，USA)，分別置入37℃恒溫干浴鍋內(nèi)溫育4h和15h進(jìn)行酶切；在20μl總反應(yīng)體系中加入MnSOD9Ala/Val基因產(chǎn)物和BsaWⅠ內(nèi)切酶(5U·μl-1，NewEnglandBioLabs，USA)，放置于60℃恒溫干浴鍋內(nèi)溫育16h進(jìn)行酶切。 4.基因型判定方法：酶切產(chǎn)物經(jīng)3.5％瓊脂糖凝膠電泳(含0.5μg·ml-1溴乙啶)，電泳緩沖液為0.5×TBE，在80V電壓下電泳40min。將瓊脂糖凝膠置于紫

8、外燈下照相判定基因型。PON155基因產(chǎn)物酶切后，LL純合子基因型個(gè)體顯示一條170bp長(zhǎng)的DNA片段，MM純合子基因型個(gè)體顯示一條126bp長(zhǎng)的DNA片段，而LM雜合子基因型個(gè)體則顯示長(zhǎng)度分別為170bp和126bp的DNA片段；PON2148基因產(chǎn)物酶切后，AA純合子基因型個(gè)體顯示一條123bp長(zhǎng)的DNA片段，GG純合子基因型個(gè)體顯示一條153bp長(zhǎng)的DNA片段，而AG雜合子基因型個(gè)體則顯示兩條長(zhǎng)度分別為123bp和153bp的DN

9、A片段。MnSOD9Ala/Val基因產(chǎn)物酶切后，AA純合子基因型個(gè)體顯示一條88bp長(zhǎng)的DNA片段，VV純合子基因型個(gè)體顯示一條172bp長(zhǎng)的DNA片段，AV雜合子基因型個(gè)體則顯示兩條長(zhǎng)度分別為88bp和172bp的DNA片段。 5.血漿T-SOD、MnSOD活性和MDA濃度測(cè)定：采用黃嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法(TBA)分別在可見(jiàn)分光光度計(jì)550nm和532nm處測(cè)定T-SOD、MnSOD活性和MDA濃度。試劑盒由南京建成

10、生物工程研究所生產(chǎn)。 6.血漿對(duì)氧磷酶測(cè)定：采用水解對(duì)氧磷生成對(duì)硝基酚的方法，在分光光度計(jì)412nm處測(cè)定對(duì)氧磷酶活性管與對(duì)照管吸光度差值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得血漿對(duì)氧磷酶活性單位。 結(jié)論： 一、冠心病患者的血漿PON、T-SOD和MnSOD活性明顯降低，MDA濃度顯著增高；PON與T-SOD顯著正相關(guān)，與MDA負(fù)相關(guān)。因此，PON和MnSOD活性與體內(nèi)抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力有關(guān)，PON和MnSOD活性下降者患冠心病的危險(xiǎn)性

11、增加。 二、PON155LM雜合子基因型的PON和T-SOD活性較LL純合子基因型明顯降低，LDL和空腹血糖增高；因此PON155Met/Leu基因多態(tài)性LM雜合子基因型和M等位基因攜帶者患冠心病的危險(xiǎn)性增加；PON155Met/Leu基因多態(tài)性是冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。 三、PON2148Ala/Gly基因多態(tài)性的GG和AG基因型的血漿PON活性較AA基因型明顯降低，并且AG基因型的空腹血糖濃度較AA基因型者明顯增高；因

12、此，GG、AG基因型和G等位基因攜帶者更易患冠心??；PON2148Ala/Gly基因多態(tài)性是冠心病的危險(xiǎn)因子。 四、MnSOD9Ala/Val基因多態(tài)性AA基因型的MnSOD活性較VV基因型者明顯減低，而空腹血糖濃度較AV雜合子基因型明顯增加；因此AA基因型和A等位基因攜帶者可能更易患冠心病。 五、本研究結(jié)果提示遺傳因素在冠心病的發(fā)生和發(fā)展中起一定的作用，為冠心病的基因診斷、疾病預(yù)防和今后的基因治療提供了參考依據(jù)。