牽張成骨過(guò)程中被動(dòng)牽拉延長(zhǎng)神經(jīng)的變化機(jī)理研究.pdf

1、肢體延長(zhǎng)（limb lengthening）是利用生物組織的“張力應(yīng)力”法則，對(duì)離斷的肢體施加牽引力，使分開(kāi)的骨段間隙被新骨取代的肢體矯形技術(shù)，也稱為牽張成骨（Distraction Osteogenesis，DO）技術(shù)。該技術(shù)目前已成為矯形外科、頜面外科畸形矯正和骨缺損治療的主要手段。關(guān)于DO過(guò)程中新生骨周?chē)谑艿綘坷能浗M織，特別是周?chē)窠?jīng)擴(kuò)展延長(zhǎng)的生物學(xué)反應(yīng)和作用機(jī)制尚未進(jìn)行深入研究和探討。然而，臨床肢體牽拉后神經(jīng)纖維的損傷所致

2、相關(guān)并發(fā)癥的持續(xù)存在和居高不下的發(fā)生機(jī)率，增加了該實(shí)驗(yàn)研究的必要性和迫切性。成骨部位的周?chē)窠?jīng)必然會(huì)受到損傷，但是在DO的礦化期會(huì)自發(fā)得到修復(fù)，究其恢復(fù)機(jī)制如何，相關(guān)參考文獻(xiàn)極少。
　　 目的：明確牽張成骨過(guò)程中周?chē)窠?jīng)再生的作用機(jī)制。（1）建立脛骨延長(zhǎng)動(dòng)物模型；（2）通過(guò)斷層切片觀察了解DO礦化期不同時(shí)段新生骨及其周?chē)M織結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)變化趨勢(shì)；（3）觀察分析牽拉延長(zhǎng)后的周?chē)窠?jīng)組織超微結(jié)構(gòu)；（4）觀察和探討神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF

3、）及其受體（p75NGFR）在肢體延長(zhǎng)過(guò)程中被動(dòng)延長(zhǎng)神經(jīng)中的表達(dá)情況和作用機(jī)制，探討牽張成骨中周?chē)粍?dòng)延長(zhǎng)組織的適應(yīng)過(guò)程，特別是被動(dòng)延長(zhǎng)周?chē)窠?jīng)的形態(tài)變遷，相關(guān)細(xì)胞因子在此適應(yīng)過(guò)程的變化趨勢(shì)。（5）初步嘗試微波輻射在免疫熒光組織化學(xué)染色中的應(yīng)用。
　　 方法：動(dòng)物模型選用日本大耳白兔，于右后肢安裝單臂外固定支架并實(shí)施脛骨干上1/3截骨術(shù)，以制備肢體延長(zhǎng)模型。術(shù)后7天開(kāi)始延長(zhǎng)，速率為1mm/d（0.5mm/d，2次/d），共計(jì)10

4、天完成延長(zhǎng)脛骨1cm。動(dòng)物模型在延長(zhǎng)及礦化過(guò)程中應(yīng)用X線攝像觀察延長(zhǎng)區(qū)域骨痂生長(zhǎng)情況；礦化期0，7，14，28，56天分設(shè)實(shí)驗(yàn)組。制備火棉膠包埋薄型化橫斷連續(xù)切片，于典型層面觀察新生骨及其周?chē)M織結(jié)構(gòu)的位置關(guān)系及進(jìn)行主要參數(shù)的測(cè)量分析；取材牽拉延長(zhǎng)的脛神經(jīng)，石蠟包埋切片進(jìn)行HE染色，新鮮取材組織進(jìn)行透射電鏡的超微組織結(jié)構(gòu)觀察；石蠟切片免疫組化和雙重免疫熒光染色，檢測(cè)NGF及其受體p75NGFR在礦化期不同時(shí)相的表達(dá)情況。應(yīng)用微波進(jìn)輻射進(jìn)

5、行抗原修復(fù)和免疫熒光檢測(cè)。
　　 結(jié)果：
　　 1.動(dòng)物模型成功制備；隨礦化期延長(zhǎng)，動(dòng)物關(guān)節(jié)活動(dòng)逐漸恢復(fù)改善；X線動(dòng)態(tài)觀察骨痂影像逐漸清晰，骨痂量逐漸增加，兩端的骨皮質(zhì)匯合，逐漸出現(xiàn)骨髓腔，皮質(zhì)骨和髓腔分界清楚，最后骨痂堅(jiān)強(qiáng)愈合，延長(zhǎng)肢體力線佳，沒(méi)有出現(xiàn)畸形愈合；
　　 2.延長(zhǎng)部位橫斷面的斷層切片觀察結(jié)果：以延長(zhǎng)骨為中心觀察周?chē)鞣N組織的位置關(guān)系及變化，測(cè)量新生骨的實(shí)際生長(zhǎng)面積以及新生骨與周?chē)窠?jīng)和血管的徑線并

6、進(jìn)行比較分析，了解肢體延長(zhǎng)過(guò)程中各組織的適應(yīng)情況；
　　 3.牽拉延長(zhǎng)神經(jīng)表現(xiàn)為牽拉外力導(dǎo)致的神經(jīng)損傷和修復(fù)過(guò)程。早期，光鏡下可見(jiàn)神經(jīng)纖維排列紊亂、郎飛氏結(jié)區(qū)增寬、髓鞘腫脹，可見(jiàn)神經(jīng)纖維擴(kuò)展性脫髓鞘電鏡下神經(jīng)纖維髓鞘板層結(jié)構(gòu)疏松，可見(jiàn)空泡狀髓鞘變性及環(huán)形小體，可見(jiàn)腫脹壓迫軸突；延長(zhǎng)后7天，光鏡下神經(jīng)纖維出現(xiàn)輕度修復(fù)性變化，電鏡下可見(jiàn)新生髓鞘；隨礦化期時(shí)間的延長(zhǎng)，神經(jīng)損傷逐漸自我修復(fù)，至礦化56天神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，但仍可觀

7、察到新生髓鞘。
　　 4.NGF和p75NGFR在脛骨延長(zhǎng)后不同礦化時(shí)期表達(dá)不同，基本表達(dá)規(guī)律為礦化早期（D7和D14組）位于軸索外層的雪旺氏細(xì)胞表達(dá)呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性，達(dá)到高峰，而DO組和D28組呈弱陽(yáng)性或陰性表達(dá)，至D56組幾乎檢測(cè)不到。
　　 5.微波輻射應(yīng)用于免疫熒光檢測(cè)可以大量節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間，染色效果較佳。
　　 結(jié)論：
　　 1.家兔是肢體延長(zhǎng)模型制作中的優(yōu)選動(dòng)物，建立的改良家兔肢體延長(zhǎng)模型可以符合后續(xù)

8、實(shí)驗(yàn)要求，獲得可靠實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。應(yīng)用X線可對(duì)延長(zhǎng)不同時(shí)期的新骨形成情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)，。
　　 2.礦化期不同時(shí)相中火棉膠薄型化橫斷面切片可以清晰觀察新骨及周?chē)飨嚓P(guān)組織結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)位置關(guān)系和變化過(guò)程，為臨床提供翔實(shí)的形態(tài)學(xué)資料；
　　 3.緩慢肢體延長(zhǎng)過(guò)程中周?chē)窠?jīng)的亞臨床損害是可逆的，在神經(jīng)損傷的同時(shí)自然修復(fù)已經(jīng)開(kāi)始。
　　 4.p75NGFR在肢體延長(zhǎng)過(guò)程中受損神經(jīng)的雪旺氏細(xì)胞中的豐富表達(dá)，證明其對(duì)于神經(jīng)的髓鞘再生和