線粒體基因組D-Loop區(qū)單核苷酸金態(tài)性與胃癌發(fā)病風(fēng)險關(guān)系的研究.pdf

1、目的:胃癌(Gastric cancer, GC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，因其病死率高，對人類的健康和生命構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。近年來，人們已注意到線粒體DNA(mitochondria DNA，mtDNA)突變及單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotide polymorphisms，SNPs)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。人類mtDNA是一條長為16569bp的雙鏈閉環(huán)分子，是細胞內(nèi)唯一存在的核外遺傳物質(zhì)，包含37個基因，其中13個參與

2、編碼電子傳遞鏈復(fù)合體的亞單位，另外的2個rRNA基因和22個tRNA基因，主要參與線粒體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成。D-環(huán)區(qū)(D-Loop區(qū))是mtDNA的非編碼區(qū)，包含mtDNA的復(fù)制起始位點和轉(zhuǎn)錄啟動子，是mtDNA分子復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的調(diào)控中心。對包括胃癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的研究發(fā)現(xiàn)，D-Loop區(qū)是mtDNA突變及多態(tài)性的熱點區(qū)域。SNPs是基因組DNA序列中由于單個核苷酸變異引起的多態(tài)性，被廣泛應(yīng)用于多基因疾病的易感基因研究領(lǐng)域。本研究通過PC

3、R產(chǎn)物直接測序的方法，對145例胃癌患者及159例正常人群外周血mtDNAD-Loop區(qū)的SNPs進行檢測，并分析和胃癌發(fā)病相關(guān)的SNPs與患者臨床特征的關(guān)系，以探索D-Loop區(qū)SNPs在胃癌形成和發(fā)展中的作用，為胃癌的早期診斷和靶向治療提供新思路。
　　方法:
　　1、研究對象及標(biāo)本采集:選取2007年9月-2008年7月于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院外三科住院且行根治術(shù)的胃癌患者145例，術(shù)前均經(jīng)內(nèi)鏡檢查、組織病理確診為胃癌。

4、在獲取患者知情同意后，采集外周靜脈血標(biāo)本3ml，準(zhǔn)確記錄所有患者的臨床特征。另選取2011年10月-2012年5月期間在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院體檢的159例正常人作為對照組，詳細記錄體檢資料，并除外與胃癌相關(guān)的疾病，采集外周靜脈血標(biāo)本3ml。所有標(biāo)本的采集均經(jīng)過河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。
　　2、線粒體DNA提取、擴增及測序:采用DNA純化試劑盒提取胃癌患者及對照組人群靜脈血標(biāo)本的線粒體DNA，DNA經(jīng)定量鑒定合格后，采用

5、PCR技術(shù)擴增目的片段，上游引物為:5'-CCCCATGCTTACAAGCAA-GT-3'，下游引物為:5'-GCTTTGAGGAGGTAAGCTAC-3'。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠純化后，進行DNA測序，測序反應(yīng)采用ABI PRISM(R)BigDyeTerminator v3.1循環(huán)測序反應(yīng)試劑盒，所用儀器為ABI PRISM(R)3730XL測序儀。同一標(biāo)本采用雙向重復(fù)測序。
　　3、統(tǒng)計分析:采用u檢驗比較計量資料，采用

6、x2檢驗比較計數(shù)資料，并計算P值、相對危險度(OR)、95％可信區(qū)間(CI)。實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.05被認為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、胃癌組與對照組臨床資料對比:年齡、性別在兩組之間無顯著性差異（P＞0.05）。
　　2、在145例胃癌患者及159例對照組人群全長為982bp測序序列中，與劍橋序列相比，共找出152個多態(tài)性變異位點，多態(tài)率為15.5％，新發(fā)現(xiàn)的變異數(shù)是

7、7個，兩組中高頻率的多態(tài)性變異數(shù)是27個。
　　3、將胃癌組與對照組D-Loop區(qū)的SNPs分布頻率進行比較分析，共發(fā)現(xiàn)5個多態(tài)性變異位點(73G/A、309C/C insert、523-524AC/del、16362T/C、16519C/T)與胃癌的發(fā)病風(fēng)險相關(guān)。其中，73G基因型在胃癌組的分布頻率是100％，對照組是56.0％，胃癌組明顯高于對照組(P=0.000)。在309位點，有64例(44.1％)胃癌患者存在1個或2個堿

8、基C的插入，對照組中有101例(63.5％)，309C insert分布頻率胃癌組明顯降低(P=0.001)。在523-524位點，胃癌組有71例(49.0％)患者AC堿基缺失，對照組有57例(35.8％)，胃癌組明顯高于對照組(P=0.021)。另外，研究發(fā)現(xiàn)16362C基因型在胃癌組分布頻率是29.0％，對照組是47.2％，胃癌組低于對照組(P=0.001)。16519C基因型的分布頻率在胃癌組是62.1％，明顯高于對照組的49.1

9、％(P=0.023)。
　　4、將與胃癌發(fā)病相關(guān)的SNPs和患者臨床特征進行比較分析，結(jié)果顯示16362C基因型在≤60歲組(38.0％)中的分布頻率較＞60歲組(20.3％)高（P=0.018），16519C基因型的分布頻率在無脈管瘤栓組(68.6％)比有脈管瘤栓組(45.0％)高(P=0.009)。其它與胃癌發(fā)病相關(guān)的SNPs和患者臨床特征，包括性別、年齡、腫瘤長徑、腫瘤位置、臨床分期、分化程度及脈管瘤栓等無關(guān)(P＞0.05)

10、。
　　結(jié)論:
　　1、胃癌患者mtDNA的D-Loop區(qū)是一個具有高度多態(tài)性的區(qū)域，多態(tài)性以單堿基置換、插入及缺失為主，主要分布于第Ⅰ高變區(qū)(HV1)和第Ⅱ高變區(qū)(HV2)。
　　2、mtDNA D-Loop區(qū)的SNPs與胃癌發(fā)病風(fēng)險有關(guān)，73G、523-524Del及16519C基因型可能增加了胃癌的發(fā)病風(fēng)險，309C insert及16362C基因型則可能降低了胃癌的發(fā)病風(fēng)險。
　　3、D-Loop區(qū)的多態(tài)