大鼠動(dòng)脈粥樣硬化及氟伐他汀干預(yù)后差異表達(dá)基因研究對(duì)HSP60、ADMR表達(dá)的影響.pdf

1、研究目的：建立大鼠動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）模型，應(yīng)用氟伐他汀進(jìn)行干預(yù)，通過(guò)基因芯片技術(shù)，分別研究在動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中以及藥物干預(yù)后基因表達(dá)的變化，為動(dòng)脈粥樣硬化的防治提供理論依據(jù)。
　　材料與方法：
　　1、普通級(jí)SD雄性大鼠45只，隨機(jī)分為3組，每組15只。A組，空白對(duì)照組；B組，AS組；C組，氟伐他汀干預(yù)組。A組喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料；B組喂養(yǎng)高脂飼料(基礎(chǔ)飼料+3％膽固醇、0.5％膽酸鈉、10％豬油、

2、0.2％丙基硫氧嘧啶和5％精制糖)+維生素D3；C組在喂養(yǎng)高脂飼料+維生素D3基礎(chǔ)上，給予氟伐他汀20mg/kg/天/只，自來(lái)水lml配制，灌胃。實(shí)驗(yàn)周期為12周。
　　2、實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)及進(jìn)程中動(dòng)態(tài)檢測(cè)各組血清甘油三脂（TG），總膽固醇（TC）及血鈣含量。
　　3、12周末處死存活大鼠，留取標(biāo)本制作切片備HE染色，剩余標(biāo)本置于液氮中速凍后-80℃保存，備用。
　　4、取出液氮保存的各組主動(dòng)脈組織進(jìn)行表達(dá)譜的基因芯片分析,

3、篩選差異表達(dá)基因。
　　5、從芯片分析結(jié)果中篩選HSP60、ADMR作為目的基因進(jìn)行重點(diǎn)研究。
　　6、應(yīng)用RT-PCR和Western blot等方法和技術(shù)觀察各組大鼠主動(dòng)脈組織HSP60、ADMR的表達(dá)特點(diǎn)。
　　結(jié)果：
　　1、AS大鼠模型的制備實(shí)驗(yàn)過(guò)程中C組大鼠飼養(yǎng)中1只死亡；B組大鼠1只AS模型未制備成功，1只死亡。
　　2、各組大鼠體重、血脂、血鈣比較0周時(shí)3組大鼠各指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨飼養(yǎng)

4、時(shí)間延長(zhǎng)，A組、C組大鼠體重逐漸增加，以A組增加明顯；B組大鼠的體重在最初8周增長(zhǎng)，到12周增長(zhǎng)減緩；但組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。血TG，TC和血鈣濃度的變化經(jīng)組間方差分析各組間存在差異，與A組相比，B組TG、TC明顯升高(P<0.05)；與B組相比，C組TG，TC顯著下降（P<0.01）。與A組相比，B組、C組血鈣均明顯升高(P<0.05)。
　　3、各組大鼠主動(dòng)脈病理改變（HE染色）：A組血管壁三層結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)膜光滑、薄，未見(jiàn)斑塊

5、生長(zhǎng)；中膜平滑肌細(xì)胞排列整齊，排列規(guī)整與內(nèi)彈力板平行。B組血管壁三層結(jié)構(gòu)欠清晰，內(nèi)膜粗糙、缺損不完整，細(xì)胞排列紊亂，中膜平滑肌增生、斷裂，排列不規(guī)則，纖維組織增生，彈性纖維層結(jié)構(gòu)不清，在纖維帽深部可見(jiàn)大量鈣化灶及無(wú)定形物質(zhì)，形成纖維增生性動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。C組血管病理介于A組與B組之間，血管壁三層結(jié)構(gòu)尚清晰，內(nèi)膜比較完整、欠光滑；可見(jiàn)鈣化灶及無(wú)定形物質(zhì)，但明顯小于B組，平滑肌細(xì)胞排列尚整齊。
　　4、22575點(diǎn)基因芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

6、B組與A組相比，上調(diào)表達(dá)的基因分別有610條，下調(diào)表達(dá)的基因分別為1018條，其中上調(diào)表達(dá)的基因包括了分子調(diào)控炎性反應(yīng)基因（TNF-α、MCP-1、NF-κB等）、生長(zhǎng)相關(guān)分子基因（TGFβ1、bFGF等）、凝血相關(guān)分子基因（TF等）、細(xì)胞增殖相關(guān)分子基因（PCNA等）、應(yīng)激相關(guān)分子基因（HSP60等）及其他種類基因（如ADMR）；C組與B組相比，上調(diào)表達(dá)的基因有2255條，下調(diào)表達(dá)的基因有844條，其中下調(diào)表達(dá)的基因包括炎性反應(yīng)基因（

7、如TNF-α、MCP-1）、生長(zhǎng)相關(guān)分子基因（如TGFβ1、bFGF）、凝血相關(guān)分子基因（如TF）、細(xì)胞增殖相關(guān)分子基因（如PCNA）等，上調(diào)表達(dá)的基因例如ADMR、PGM1等。
　　5、HSP60mRNA的表達(dá)：B組較A組明顯升高（P<0.05），C組較B組無(wú)明顯差異（P>0.05）。
　　6、ADMRmRNA和蛋白的表達(dá)：B組較A組明顯升高，C組較B組顯著升高（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、采用高脂飲

8、食+維生素D3的方式，成功建立了實(shí)驗(yàn)性AS的動(dòng)物模型。
　　2、對(duì)AS大鼠進(jìn)行的基因芯片的表達(dá)譜分析結(jié)果表明，與A組相比，B組主動(dòng)脈組織基因表達(dá)產(chǎn)生了嚴(yán)重紊亂，多種基因表達(dá)得以上調(diào)和下調(diào)，這些差異性表達(dá)基因分別與炎癥、凝血、氧化應(yīng)激、細(xì)胞增殖等相關(guān)。說(shuō)明AS的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，有多種因素參與。
　　3、對(duì)AS大鼠進(jìn)行氟伐他汀干預(yù)的基因芯片的表達(dá)譜分析結(jié)果表明，與B組相比，C組基因表達(dá)產(chǎn)生了新的變化，和炎癥、凝血、細(xì)胞增殖有關(guān)

9、的多種基因表達(dá)下調(diào)。進(jìn)一步驗(yàn)證了他汀類藥物的“多效性”。
　　4、AS過(guò)程中可檢測(cè)到HSP60表達(dá)升高，氟伐他汀干預(yù)后其表達(dá)變化不明顯。
　　5、HSP60可能是與血脂水平無(wú)關(guān)的動(dòng)脈粥樣硬化預(yù)測(cè)因子，可能未參與氟伐他汀抗AS的分子機(jī)制。
　　6、AS過(guò)程中可檢測(cè)到ADMR表達(dá)升高，氟伐他汀干預(yù)后ADMR基因表達(dá)進(jìn)一步升高，提示ADMR可能參與了氟伐他汀抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制。
　　綜上所述，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用基因芯片技