抑郁癥血漿microRNA表達(dá)譜及潛在診斷標(biāo)志物的研究.pdf

1、背景：
　　抑郁癥是最常見(jiàn)的精神疾病之一，其發(fā)病率和復(fù)發(fā)率高，而就診率和治愈率低，這給個(gè)人、家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。目前抑郁癥的診治仍存在諸多挑戰(zhàn)，主要有：（1）發(fā)病機(jī)制研究尚停留在各種假說(shuō)層面，如單胺類神經(jīng)遞質(zhì)假說(shuō)、細(xì)胞因子假說(shuō)、下丘腦-垂體-腎上腺軸假說(shuō)、表觀遺傳調(diào)控假說(shuō)以及神經(jīng)發(fā)生障礙和突觸可塑性異常假說(shuō)等。（2）缺乏客觀有效的輔助診斷指標(biāo)/方法。（3）抗抑郁藥物起效慢，對(duì)部分患者療效差。因此，目前迫切需要繼續(xù)探索抑郁癥

2、的病理生理機(jī)制，發(fā)現(xiàn)早期診斷的生物標(biāo)志物以及新的治療靶點(diǎn)。
　　microRNA（miRNA）是長(zhǎng)約19~23nt的RNA分子，在基因表達(dá)過(guò)程中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，在腫瘤等臨床疾病的病理生理機(jī)制探索及潛在疾病診斷生物標(biāo)志物篩選等領(lǐng)域中有廣泛的研究前景。文獻(xiàn)報(bào)道，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在腦組織特異性或富集表達(dá)的miRNA，急性或慢性應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致一些miRNA表達(dá)失調(diào)。故我們推測(cè)，miRNA在抑郁癥的病理生理過(guò)程中扮演重要角色，并可能通過(guò)表達(dá)譜及

3、靶向分析尋找到潛在的抑郁癥診斷標(biāo)志物。
　　目的：
　　分別基于鎖核酸雜交芯片技術(shù)和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)抑郁癥患者血漿差異miRNA進(jìn)行表達(dá)譜分析及靶向研究，初步探討差異miRNA在抑郁癥病理生理機(jī)制中的潛在作用及其臨床意義，為篩選抑郁癥診斷標(biāo)志物提供研究基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.提供臨床樣本志愿者招募：本研究在重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院精神科門診收集重性抑郁障礙及雙向情感障礙患者；在重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院體檢

4、中心收集正常對(duì)照者；在重慶市精神病院住院部收集精神分裂癥患者。精神疾病患者分別由兩名精神科專家依據(jù)《精神疾病診斷和統(tǒng)計(jì)手冊(cè)》（DSM-IV）對(duì)患者進(jìn)行診斷。對(duì)上述三種精神疾病患者分別進(jìn)行漢密爾頓抑郁量表、貝克抑郁自評(píng)量表、Beck-Rafaelsen躁狂量表及陽(yáng)性與陰性癥狀量表進(jìn)行疾病嚴(yán)重程度評(píng)分。所有試驗(yàn)對(duì)象入組時(shí)均進(jìn)行血常規(guī)及血生化（肝腎功能）檢查。嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)擬定的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)入組實(shí)驗(yàn)對(duì)象。所有納入研究的志愿者均簽署了書(shū)面知

5、情同意書(shū)。第一部分納入30例實(shí)驗(yàn)對(duì)象（抑郁癥16例，正常對(duì)照14例）。第二部分第一階段納入70例實(shí)驗(yàn)對(duì)象（抑郁癥和正常對(duì)照各35例），第二階段納入300例實(shí)驗(yàn)對(duì)象（抑郁癥100例，雙向情感障礙和精神分裂癥各50例，正常對(duì)照100例）。
　　2.抑郁動(dòng)物模型的建立：采用慢性不可預(yù)見(jiàn)性溫和刺激對(duì)大鼠進(jìn)行抑郁模型建造，運(yùn)用體重、糖水消耗實(shí)驗(yàn)及曠野實(shí)驗(yàn)判定抑郁大鼠模型建立成功與否。
　　3.實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的采集與保存：臨床血液用EDTA抗

6、凝的真空采血管經(jīng)靜脈穿刺采集，大鼠血液經(jīng)水合氯醛深麻醉大鼠后通過(guò)心尖穿刺獲取，并于采集后1小時(shí)內(nèi)進(jìn)行分離血漿處理，血漿分裝后-80°C保存?zhèn)溆?。大鼠心臟采血結(jié)束后斷頭處死，解剖分離腦組織，取前額葉、海馬及嗅球組織后放入1.5ml去RNA酶EP管中，液氮速凍，最后所有標(biāo)本-80°C保存?zhèn)溆谩?br>　　4.采用TrizolRNA提取法提取血漿及腦組織RNA。抽提后的RNA采用紫外吸收法測(cè)定RNA濃度與純度，采用變性瓊脂糖凝膠電泳判斷RNA

7、的完整性和基因組DNA污染。
　　5.基于鎖核酸miRNA雜交芯片技術(shù)，分析抑郁癥和正常對(duì)照血漿的miRNA表達(dá)譜，設(shè)定倍數(shù)差異>1.3，P值<0.05為閾值判斷抑郁癥患者血漿的差異表達(dá)miRNA，建立抑郁癥血漿miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)。
　　6.通過(guò)對(duì)差異miRNA的靶基因分析、GeneOntology及Pathway分析等生物信息學(xué)手段，初步探索差異miRNA在抑郁癥病理生理機(jī)制中的潛在作用。
　　7.運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PC

8、R方法，檢測(cè)血漿、腦組織miR-134的表達(dá)，觀察該指標(biāo)在抑郁癥是否存在改變，并判斷其在抑郁癥中的診斷價(jià)值。
　　結(jié)果：
　　1.通過(guò)芯片表達(dá)譜分析（抑郁癥16例，正常對(duì)照14例），發(fā)現(xiàn)75個(gè)差異表達(dá)miRNA，其中含未命名的miRNA序列6個(gè)；含病毒編碼的miRNA序列8個(gè)，其中顯著上調(diào)的病毒編碼miRNA有ebv-miR-BART6-3p和hsv2-miR-H4-3p，上調(diào)倍數(shù)分別為1.45倍及1.795倍；hsa-mi

9、R-124-3p、hsa-miR-652-3p、hsa-miR-147b、hsa-miR-196a-3p、hsa-miR-1255a、hsa-miR-604、hsa-miR-511、hsa-let-7a-5p八個(gè)差異miRNA在抑郁組和對(duì)照組中的區(qū)分度最為明顯。進(jìn)一步對(duì)所有差異miRNA進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其參與MAPK及Wnt信號(hào)通路的調(diào)控，另外還參與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的信號(hào)途徑，以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)發(fā)生和突觸可塑性調(diào)控等。

10、　　2.通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR分析，在35例抑郁癥及35例正常對(duì)照血漿中初步發(fā)現(xiàn)抑郁組血漿miR-134水平明顯低于對(duì)照組，經(jīng)常用抗抑郁治療后隨癥狀好轉(zhuǎn)血漿miR-134水平亦回復(fù)，但仍明顯低于對(duì)照組。抑郁癥患者中，更低的血漿miR-134水平提示較差的預(yù)后。進(jìn)一步擴(kuò)大樣本到100例抑郁癥、100例正常對(duì)照、50例雙向情感障礙、50例精神分裂癥后發(fā)現(xiàn)，抑郁組、雙向情感障礙組及精神分裂組血漿miR-134水平均顯著低于對(duì)照組，但抑郁組較雙向情

11、感障礙及精神分裂組的血漿miR-134水平更低，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。血漿miR-134在抑郁癥及正常對(duì)照人群中診斷抑郁癥的靈敏度為79％，特異性84%，在抑郁癥、雙向情感障礙、精神分裂癥及正常對(duì)照人群中診斷抑郁癥的靈敏度為79%，特異性76.5%。與臨床樣本研究的結(jié)果一致，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)慢性應(yīng)激導(dǎo)致大鼠血漿及海馬、前額葉皮質(zhì)的miR-134水平明顯下調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1.八個(gè)差異miRNA在抑郁組和對(duì)照組中的區(qū)分度最為