登革-2型病毒E蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ表位肽誘導(dǎo)B和T細(xì)胞免疫應(yīng)答的研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　 登革病毒(Dengue virus,DEN)為黃病毒科(Flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirus)成員,含4個(gè)血清型(DEN-1、-2、-3和-4)。登革病毒為單股正鏈RNA病毒,共11kb,其基因組可分為兩部分:5ˋ端1/4的序列編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白；3ˋ端3/4的序列編碼病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白,編碼結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白的基因順序?yàn)?5ˋUTR-C-prM(M)-E-NS1-NS2a-NS2b-

2、NS3-NS4a-NS4b-NS5-UTR3ˋ。
　　 登革病毒的感染已成為世界性衛(wèi)生問題。登革病毒感染可引起登革熱(Dengue fever,DF),登革出血熱(Dengue hemorrhagic fever,DHF)以及登革休克綜合征(Dengue shock syndrome,DSS),主要流行于熱帶與亞熱帶地區(qū),每年約新增5億感染病例,全球25億人正面臨著登革病毒的感染。它的傳播媒介主要是埃及伊蚊和白紋伊蚊,目前,登革

3、的預(yù)防主要通過切斷蚊媒傳播,尚無有效的疫苗用于預(yù)防。
　　 現(xiàn)今登革疫苗研究較有成效的有減毒活疫苗,嵌合病毒疫苗,重組亞單位疫苗,DNA疫苗等,但都存在安全性差,有效性不高的問題。研制登革疫苗困難的因?yàn)橹饕?(1)登革病毒的致病機(jī)理尚不明確；(2)尚無合適的動(dòng)物模型模擬DHF/DSS的發(fā)病過程；(3)研制的疫苗需對(duì)四個(gè)血清型的DEN感染均有保護(hù)作用,增加了疫苗研制的難度；(4)研制周期長(zhǎng),潛在的副作用限制等。
　　 現(xiàn)

4、今,新型的多表位肽疫苗成為登革疫苗研究的新方向。自20世紀(jì)80年代Strohmaier等人發(fā)現(xiàn)口蹄疫病毒的146-154及200-213位氨基酸序列含有抗原性位點(diǎn),從而找到了一種新型的疫苗,即表位疫苗。多表位肽疫苗具有安全性好、高度特異性、易保存和使用方便等優(yōu)點(diǎn)。隨著分子免疫學(xué),分子生物學(xué)和生物工程信息學(xué)的發(fā)展,為病毒尋找抗原性表位提供了捷徑。近年來表位肽疫苗已成為疫苗研究的熱點(diǎn)。在抗病毒表位肽疫苗的研究中,現(xiàn)有HIV(Humanimm

5、unodeficiency virus)、HCV(Hepatitis C virus)和HPV(Human papillomavirus)等多表位肽疫苗進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。
　　 理想的多表位肽疫苗需免疫原性強(qiáng),能誘導(dǎo)機(jī)體既產(chǎn)生體液免疫又產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答。登革病毒的E蛋白(envelope glycoprotein)是公認(rèn)的可引起機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫的重要抗原蛋白,其含有可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的抗原決定簇。E蛋白為糖蛋白,位于病毒表

6、位構(gòu)成病毒顆粒表面的突起,以同源二聚體的形式存在,它介導(dǎo)病毒和細(xì)胞受體的結(jié)合,使病毒進(jìn)入細(xì)胞,發(fā)生感染。E蛋白單體可分為三個(gè)結(jié)構(gòu)域(Domain):DⅠ、DⅡ和DⅢ?？笵Ⅱ和DⅢ的抗體都可以表現(xiàn)出中和病毒的作用,但抗DⅢ的抗體表現(xiàn)出極強(qiáng)的中和病毒作用,病毒型特異性更強(qiáng)。
　　 本研究以DEN-2 NGC株E蛋白的DⅢ為研究對(duì)象,應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù),通過網(wǎng)絡(luò)生物信息學(xué)軟件和DNAstar等軟件對(duì)E蛋白和E蛋白的B、T細(xì)胞表位分析,

7、認(rèn)為DⅢ免疫原性強(qiáng)和特異性好,其中RHVLGRLITVNPIVTE345～359和EPGQLKLNWFKKGSS E383～397序列最有可能為T和B細(xì)胞表位。
　　 在亞單位疫苗的研究中,Consogno等在設(shè)計(jì)腫瘤多表位肽疫苗的研究中,預(yù)測(cè)雜合性T細(xì)胞表位,Th表位預(yù)測(cè)的一項(xiàng)重要成果是泛DR表位(pan-DRepitope,PADRE),它是一含13個(gè)氨基酸殘基的人造通用型Th細(xì)胞表位,序列為AKFVAAWTLKAAA等。實(shí)

8、驗(yàn)證明將PADRE與T表位或B細(xì)胞表位串聯(lián)構(gòu)建的多表位肽疫苗可以誘導(dǎo)高效的細(xì)胞或體液免疫應(yīng)答,而且還發(fā)現(xiàn)PADRE對(duì)人體安全,無毒副作用。
　　 本研究將初步驗(yàn)證的登革病毒E蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ的T細(xì)胞表位(RHVLGRLITVNPIVTE345～359)和B細(xì)胞表位(EPGQLKLNWFKKGSS E383～397)連同PADRE串聯(lián)成線性多表位肽結(jié)構(gòu),中間間隔GG氨基酸序列,用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)多表位肽進(jìn)行分析,合成P1(AKFVAAWT

9、LKAAAGGRHVLGRLITVNPIVTGGEPGQLNWFKKGSS,純度96.5％)線性多表位肽。同時(shí)合成一同行對(duì)照肽P2(AKFVAAWTLKAAAGGKKSKAINVLGGIGESHFK GLVLI,純度76.7％),其中P2序列中除PADRE序列與P1相同外,其他氨基酸序列為隨意序列。將線性表位肽免疫C57BL/6j小鼠,觀察其誘導(dǎo)體液、細(xì)胞免疫應(yīng)答和保護(hù)性效應(yīng)。
　　 研究方法
　　 1、多表位肽的生物信

10、息學(xué)分析
　　 運(yùn)用在線的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器http://www.expasy.org/cgi-bin/protparam分析多表位肽P1的分子量、等電點(diǎn)和穩(wěn)定性分析等情況。運(yùn)用DNAstar軟件分析多表位肽P1的α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角和免疫原性所在區(qū)段。使用http://blast.ncbi.nlm.nih.gov的網(wǎng)絡(luò)BLAST分析,觀察多表位肽氨基酸序列的病毒型特異性。采用http://www.cbs.dtu.dk/service

11、s/SignalP/的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器預(yù)測(cè)多表位肽有無信號(hào)肽,及對(duì)信號(hào)肽切割位點(diǎn)進(jìn)行分析。
　　 2、線性表位肽誘導(dǎo)的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答
　　 SPF級(jí)4-6周齡雌性C57BL/6j小鼠共30只,隨機(jī)分為P1組、P2組和PBS陰性對(duì)照組,每組共10只。每組相應(yīng)免疫P1和P2,量100μg/只100μL,PBS陰性對(duì)照組免疫PBS緩沖液100μL,各免疫原與等體積的弗氏佐劑乳化后,腹部皮下多點(diǎn)注射,免疫三次,每次免疫間隔兩周。分

12、別于免疫前,免疫后第1、2和3次后兩周(即免疫后2、4和6周)剪鼠尾采血,待其凝固后離心取血清,加入等量甘油凍純于-20℃。經(jīng)間接ELISA檢測(cè)不同組別的小鼠于免疫后第2、4和6周的抗體滴度。每組隨機(jī)抽取7份免疫血清標(biāo)本,在2倍稀釋梯度下測(cè)OD450nm吸光度A值,以免疫前小鼠血清作陰性對(duì)照組。以待測(cè)標(biāo)本Dλ值/陰性對(duì)照Dλ九值>2.1為陽(yáng)性,出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)的最高稀釋度作為該標(biāo)木的滴度。
　　 用100TCID50 DEN-2 N

13、GC感染將24孔板內(nèi)Vero細(xì)胞,96小時(shí)后固定透化,分別加入不同免疫組別的多抗血清(P1、P2和PBS免疫后多抗血清、免疫前血清和兔抗登革病毒多抗血清)孵育過夜,洗滌后加入FITC-抗小鼠IgG或抗兔IgG,37℃孵育20min后洗滌,熒光顯微鏡下觀察。
　　 同前法免疫小鼠,于末次免疫后兩周分離小鼠脾淋巴細(xì)胞,以2.5×106個(gè)/mL的細(xì)胞溶度種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,分別加入不同刺激原P1和P2各為25μg/mL,半適量PHA

14、 5μg/mL,PBS 5μL/mL,完全培養(yǎng)基陰性對(duì)照組,同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組。孵育48小時(shí)后,加入CCK-8試劑,繼續(xù)培養(yǎng)5小時(shí)后測(cè)OD450nm吸光度A值,以公式:刺激指數(shù)=(樣本孔吸光值-空白孔吸光值)/(陰性對(duì)照孔吸光值-空白孔吸光值)×100％為準(zhǔn),計(jì)算刺激指數(shù)。
　　 按前法將小鼠免疫P1后,分離小鼠脾淋巴細(xì)胞種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,加入不同的刺激原(P1和P2各25μg/mL,PBS 5μL/mL,重復(fù)例數(shù)為4),孵

15、育6小時(shí)后,按細(xì)胞因子染色試劑盒說明書操作方法對(duì)脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)因子染色,后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
　　 3、線性表位肽的保護(hù)性研究
　　 小鼠共20只,免疫法同前,分為P1、P2和PBS免疫組及空白組,每組共5只,腹腔注射感染DEN-2 NGC株2×109copies/只100μL,于感染后第1、3和5天剪鼠尾采血150μL,Trizol法提取全血總RNA,逆轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA后,用絕對(duì)定量Real-time PCR

16、法測(cè)定病毒載量。
　　 隨機(jī)抽取不同免疫組別(P1、P2和PBS免疫組)末次免疫多抗血清3份,做2倍稀釋梯度,從1:2至1:128,同時(shí)用完全培養(yǎng)基為陰性對(duì)照組。將100TCID50病毒懸液與不同稀釋度的實(shí)驗(yàn)血清等體積混合,37℃水浴孵育1小時(shí)后感染已鋪種Vero細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板內(nèi)。孵育后棄病毒上清液,加入含4％FBS的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)于5％CO237℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。每日顯微鏡下觀察細(xì)胞病變,共觀察7天,能抑制病變的50

17、％的血清稀釋度即為陽(yáng)性。
　　 結(jié)論
　　 1、生物信息學(xué)分析表明,表位肽P1具有型特異性、免疫原性和信號(hào)肽結(jié)構(gòu)。
　　 2、P1為完全抗原,即有免疫原性又有反應(yīng)原性。P1肽可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生極高的抗體滴度,同時(shí)免疫后的雙表位抗血清可與登革病毒結(jié)合。P1作為刺激原,可誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞發(fā)轉(zhuǎn)化,使Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞漂移,以增加CTL細(xì)胞效應(yīng)。
　　 3、免疫P1的C57BL/6j小鼠可以產(chǎn)生中和DEN-2 NG