KGF和TGF-β1噬菌體模擬肽改善創(chuàng)面愈合質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、創(chuàng)面愈合是一個(gè)組織缺損修復(fù)的復(fù)雜過(guò)程,異常的創(chuàng)面愈合會(huì)導(dǎo)致慢性難愈性創(chuàng)面和瘢痕增生。糖尿病患者和長(zhǎng)期臥床患者經(jīng)常出現(xiàn)慢性難愈性創(chuàng)面,是臨床上常見(jiàn)的和需要解決的難題。瘢痕疙瘩是一種特殊類型的病理性瘢痕,影響患者的功能和外觀,治療后經(jīng)常復(fù)發(fā),難以成功防治。
　　 角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Keratinoeyte growth factor,KGF)是一種上皮細(xì)胞特異性的多功能的生長(zhǎng)因子,由間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生,通過(guò)旁分泌機(jī)制分泌,與上皮創(chuàng)面愈合、

2、胚胎發(fā)育、腫瘤的形成與發(fā)展及免疫重建等方面關(guān)系密切。發(fā)生創(chuàng)傷時(shí),創(chuàng)面下的成纖維細(xì)胞分泌KGF,KGF促進(jìn)角質(zhì)化細(xì)胞增殖、遷移,以及細(xì)胞骨架重排,顯著影響上皮的創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程。然而,KGF的致瘤性限制了其廣泛應(yīng)用。
　　 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)是目前已知的與瘢痕形成關(guān)系最密切、最具代表性的促細(xì)胞分裂誘導(dǎo)劑,是最強(qiáng)的纖維化促進(jìn)因子。TGF-β1能夠促進(jìn)血管化,誘導(dǎo)肉芽組

3、織形成,刺激細(xì)胞外基質(zhì)蛋白合成和沉積,同時(shí)抑制膠原酶產(chǎn)生,促進(jìn)傷口纖維化。相對(duì)于正常皮膚,瘢痕疙瘩高表達(dá)TGF-β1。TGF-β1通過(guò)TGF-β1信號(hào)通路影響瘢痕的形成,TβRⅡ、Smad、MAPK、NF-kappa B和CTGF是TGF-β1信號(hào)通路的重要的細(xì)胞內(nèi)介質(zhì),通過(guò)調(diào)整TGF-β1信號(hào)通路可以達(dá)到防治瘢痕增生的目的,是目前的研究熱點(diǎn),具有很好的研究及應(yīng)用前景。
　　 噬菌體展示肽庫(kù)技術(shù)是以單克隆抗體或者細(xì)胞為靶,篩選模

4、擬性抗原表位和配體的技術(shù),該技術(shù)已在受體阻斷劑和激動(dòng)劑的獲得,多肽疫苗的輔助設(shè)計(jì),多肽靶向藥物的開(kāi)發(fā)等多個(gè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。噬菌體M13是一種較好的生長(zhǎng)因子載體,具有低免疫源性、易擴(kuò)散性、以融合蛋白的形式穩(wěn)定表達(dá)外源多肽、并能幫助外源多肽抵抗創(chuàng)面復(fù)雜環(huán)境的影響等優(yōu)點(diǎn)。
　　 為此,本研究從噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)中篩選獲得KGF和TGF-β1的噬菌體模擬肽；檢測(cè)KGF噬菌體模擬肽對(duì)表皮細(xì)胞增殖的影響,并根據(jù)序列分析和離體細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果,選擇

5、KGF的特異性序列,構(gòu)建表達(dá)pComb3-KGF活性肽,用于促進(jìn)創(chuàng)面愈合；檢測(cè)TGF-β1噬菌體模擬肽對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的活性的影響,挑選具有競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的噬菌體模擬肽,用于防治瘢痕增生。關(guān)于此方面的研究尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。
　　 第一部分 KGF噬菌體模擬肽的篩選及促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖的研究
　　 目的：應(yīng)用噬菌體隨機(jī)7肽庫(kù)生物淘選具有促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖作用的KGF噬菌體模擬肽。
　　 方法以KGF單克隆抗體為靶,進(jìn)

6、行4輪生物淘選噬菌體隨機(jī)7肽庫(kù),測(cè)定噬菌體的滴度,計(jì)算噬菌體的回收率；4輪生物淘選后,隨機(jī)挑取單克隆噬菌體,進(jìn)行ELISA檢測(cè),選擇結(jié)合活性較好的單克隆噬菌體,對(duì)模擬肽的DNA序列進(jìn)行測(cè)序,分析序列的相似性；應(yīng)用MTT方法檢測(cè)噬菌體模擬肽促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖的作用；應(yīng)用免疫熒光方法鑒定噬菌體模擬肽的細(xì)胞親和力；應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)噬菌體模擬肽組及對(duì)照組中的KGFR、人β-防御素3、c-Fos和c-Jun的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：

7、經(jīng)過(guò)4輪生物淘選,特異性噬菌體模擬肽獲得了富集,從噬菌體隨機(jī)7肽庫(kù)中篩選獲得了25種噬菌體模擬肽,ELISA結(jié)果顯示部分噬菌體模擬肽具有較好的特異性；MTT結(jié)果顯示4種噬菌體模擬肽能夠促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖:免疫熒光鑒定結(jié)果顯示能夠促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖的噬菌體模擬肽具有較好的細(xì)胞親和力；RT-PCR結(jié)果顯示KGFR和人β-防御素3在KGF對(duì)照組和2種噬菌體模擬肽組中高表達(dá),c-Fos和c-Jun在KGF對(duì)照組中高表達(dá),而在噬菌體模擬肽組中表達(dá)不增

8、加。
　　 結(jié)論：從噬菌體隨機(jī)7肽庫(kù)中生物淘選到了KGF噬菌體模擬肽,能夠顯著促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖；2種噬菌體模擬肽能夠促進(jìn)人β-防御素3的表達(dá),有助于控制創(chuàng)面感染；噬菌體模擬肽不會(huì)促進(jìn)腫瘤基因c-Fos和c-Jun的表達(dá),安全性較好。
　　 第二部分 pComb3-KGF活性肽的構(gòu)建及促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖的研究
　　 目的：依據(jù)前述噬菌體生物淘選和離體細(xì)胞試驗(yàn)的結(jié)果,選擇特異性的KGF序列,構(gòu)建展示pComb3-KGF

9、活性肽,檢測(cè)其促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖的作用。
　　 方法以噬菌粒pComb3為載體,選取載體的重鏈作為基因插入位置,以SpeⅠ和XhoⅠ作為限制性內(nèi)切酶。依據(jù)生物淘選和離體試驗(yàn)的結(jié)果,選取4個(gè)序列,設(shè)計(jì)引物；應(yīng)用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)獲得人皮膚真皮的成纖維細(xì)胞,提取人成纖維細(xì)胞總RNA,應(yīng)用RT-PCR方法獲得目的基因；SpeⅠ和XhoⅠ雙酶切目的基因及噬菌粒pComb3,將目的基因亞克隆至pComb3；應(yīng)用噬菌體呈現(xiàn)技術(shù),將插入的目的基因

10、展示于噬菌體表面；抽提純化噬菌體DNA,進(jìn)行酶切、PCR和測(cè)序鑒定；應(yīng)用MTT方法檢測(cè)pComb3-KGF活性肽促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖的作用,應(yīng)用免疫熒光方法檢測(cè)pComb3-KGF活性肽的細(xì)胞親和力,應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)pComb3-KGF活性肽對(duì)KGFR、人β-防御素3、c-Fos和c-Jun的表達(dá)水平的影響。
　　 結(jié)果：應(yīng)用RT-PCR方法獲得目的基因,并構(gòu)建在噬菌粒pComb3中,酶切、PCR和測(cè)序結(jié)果證實(shí)目的基因已成功

11、構(gòu)建在載體中；目的基因成功表達(dá)于載體表面；MTT結(jié)果顯示4種pComb3-KGF活性肽均能夠促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖；免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示其具有較好的細(xì)胞親和力；RT-PCR結(jié)果顯示KGF及兩種pComb3-KGF活性肽能夠促進(jìn)KGFR的表達(dá),KGF及3種pComb3-KGF活性肽能夠促進(jìn)人β-防御素3的表達(dá),4種pComb3-KGF活性肽促進(jìn)c-Fos和c-Jun表達(dá)的作用均弱于野生型的KGF。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建展示獲得pComb

12、3-KGF活性肽,能夠顯著促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖,能夠促進(jìn)人β-防御素3的表達(dá),有助于控制創(chuàng)面感染,但促進(jìn)腫瘤基因c-Fos和c-Jun的表達(dá)弱于野生型的KGF。
　　 第三部分 TGF-β1噬菌體模擬肽的篩選及拮抗瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞活性的研究
　　 目的：檢測(cè)從噬菌體隨機(jī)7/12肽庫(kù)中生物淘選的TGF-β1噬菌體模擬肽對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的活性的影響,評(píng)估其拮抗瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞活性的作用。
　　 方法以人TGF-β

13、1單克隆抗體為靶,進(jìn)行4輪生物淘選噬菌體隨機(jī)7/12肽庫(kù),期望獲得包含類似于TGF-β1的外源性模擬肽的噬菌體模擬肽；隨機(jī)挑取單克隆噬菌體,進(jìn)行ELISA檢測(cè),對(duì)結(jié)合活性較好的單克隆噬菌體提取噬菌體DNA,進(jìn)行測(cè)序,并進(jìn)行序列分析；應(yīng)用MTT方法評(píng)估噬菌體模擬肽對(duì)正常成纖維細(xì)胞和瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖的影響；應(yīng)用annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒和流式細(xì)胞儀檢測(cè)噬菌體模擬肽誘導(dǎo)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡的作用；應(yīng)用免疫熒光方法

14、檢測(cè)模擬肽的細(xì)胞親和力；應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中NF-Kappa B,CTGF和TβRⅡ的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：經(jīng)過(guò)4輪生物淘選,特異性噬菌體模擬肽獲得了富集,從噬菌體隨機(jī)7肽庫(kù)中篩選獲得了4種噬菌體模擬肽,從噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)中篩選獲得了10種噬菌體模擬肽；ELISA結(jié)果顯示具有較好的特異性；MTT結(jié)果顯示7種噬菌體模擬肽能夠抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖,并促進(jìn)其凋亡；免疫熒光鑒定顯示噬菌體模擬肽具有較好的