血管生成素-1，-2在胃癌中的表達(dá)及調(diào)節(jié)機(jī)制研究.pdf

1、目的: (1)分析Ang-1，-2及Tie2在胃癌組織和胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)及意義； (2)研究COX-2對(duì)Ang-1及-2的調(diào)控作用及可能機(jī)制； (3)探討缺氧對(duì)Ang-1及-2表達(dá)的調(diào)控作用及其可能機(jī)制。 方法: (一)分析Ang-1,-2及Tie2在胃癌組織和胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)： (1)采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)Ang-1及-2在53例胃癌組織及23例正常胃粘膜中的表達(dá)，并分析其表達(dá)與胃

2、癌患者臨床資料的關(guān)聯(lián)性； (2)westernblot法檢測(cè)12對(duì)胃癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織中Ang-1，-2及Tie2的表達(dá)； (3)RT-PCR和westernblot方法檢測(cè)Ang-1，-2及Tie2在7種胃癌細(xì)胞系及1株永生化胃粘膜上皮細(xì)胞中的表達(dá)； (二)研究COX-2對(duì)Ang-1及-2的調(diào)控作用及可能機(jī)制： (4)采用RT-PCR和westernblot方法檢測(cè)COX-2表達(dá)受到抑制的7901AS

3、細(xì)胞中Ang-1及-2的表達(dá)； (5)采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)7901AS和空載體轉(zhuǎn)染的7901P細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成瘤組織中Ang-1及-2的表達(dá)； (6)COX-2正義載體轉(zhuǎn)染COX-2低表達(dá)的MGC803細(xì)胞，westernblot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中Ang-1及-2的表達(dá)變化； (7)COX-1特異性抑制劑SC-560、消炎痛及COX-2特異性抑制劑塞來昔布不同作用時(shí)間處理SGC7901細(xì)胞，用RT-PCR和W

4、esternblot方法檢測(cè)Ang-1及-2的表達(dá)變化； (8)不同劑量消炎痛及塞來昔布處理SGC7901細(xì)胞，用RT-PCR和Westernblot方法檢測(cè)Ang-1及-2的表達(dá)變化； (9)利用PGE2試劑盒檢測(cè)不同處理組細(xì)胞上清中PGE2的含量； (10)用RT-PCR法檢測(cè)SGC7901細(xì)胞中EP受體的表達(dá)； (11)1μMPGE2孵育SGC7901細(xì)胞24h后，westernblot法檢測(cè)Ang

5、-1及-2的表達(dá)變化； (12)不同EP受體擬似劑、拮抗劑處理SGC7901細(xì)胞后，westernblot法檢測(cè)Ang-1及-2的表達(dá)變化； (三)探討缺氧對(duì)Ang-1及-2表達(dá)的調(diào)控作用及其可能機(jī)制： (13)用RT-PCR和westernblot方法檢測(cè)缺氧處理SGC7901細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-induciblefactorα，HIF-1α)、Ang-1、Ang-2及COX-1、CO

6、X-2的表達(dá)變化； (14)100μM氯化鈷(cobaltchloride，CoCl2)處理SGC7901細(xì)胞，用westernblot方法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)Ang-2的表達(dá)變化； (15)缺氧處理SGC7901細(xì)胞的同時(shí)，加入不同劑量的小分子化合物genestein阻斷HIF-1α的表達(dá)，用westernblot法檢測(cè)Ang-2的表達(dá)變化； (16)缺氧處理SGC7901細(xì)胞時(shí)同時(shí)加入不同劑量的塞來昔布，用west

7、ernblot法觀察Ang-2的表達(dá)變化； (17)利用PGE2試劑盒檢測(cè)缺氧及相應(yīng)處理組細(xì)胞條件培養(yǎng)基中PGE2含量； (18)塞來昔布干預(yù)缺氧培養(yǎng)SGC7901細(xì)胞的同時(shí)，加入5μM外源性PGE2，用westernblot法檢測(cè)Ang-2的表達(dá)變化。 結(jié)果: (1)免疫組化結(jié)果提示，與正常胃粘膜相比，胃癌組織中Ang-1、Ang-2表達(dá)明顯增高，Ang-1的陽性率為66％(35/53，與正常胃粘膜相比P

8、＜0.05)、Ang-2陽性率為74％(39/53，，與正常胃粘膜相比P＜0.01)；其中Ang-1可能與胃癌的組織分化呈負(fù)相關(guān)；Ang-2可能與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移正相關(guān)； (2)westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與對(duì)應(yīng)癌旁組織相比，胃癌組織中Ang-2及Tie2表達(dá)顯著增高，而Ang-1的表達(dá)顯示出一定的不均一性，7例表達(dá)顯著增高，5例表達(dá)無顯著差異； (3)RT-PCR和westernblot結(jié)果顯示，多種

9、胃癌細(xì)胞系中Ang-1及-2均有顯著表達(dá)，以AGS和SGC7901細(xì)胞表達(dá)最高；Tie2也均有陽性表達(dá)； (4)AGS細(xì)胞中存在著Ang-2mRNA的一種剪接體形式Ang-2443，其他胃癌細(xì)胞系中未檢測(cè)到類似表達(dá)； (5)7901AS細(xì)胞中Ang-1及-2的表達(dá)無論是mRNA還是蛋白水平均顯著降低；其裸鼠體內(nèi)成瘤組織中Ang-1及-2的表達(dá)亦顯著降低； (6)COX-2正義載體轉(zhuǎn)染的MGC803細(xì)胞中Ang-1

10、及-2的表達(dá)較空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞顯著增高； (7)20μM塞來昔布或50μM消炎痛可以顯著抑制Ang-1及-2的表達(dá)，且作用48h抑制效應(yīng)較24h強(qiáng)，而20μMSC-560對(duì)Ang-1及-2表達(dá)的影響不明顯； (8)不同濃度的塞來昔布及消炎痛可以劑量依賴性抑制SGC7901細(xì)胞中Ang-1及-2的表達(dá)，塞來昔布效應(yīng)：50μM＞20μM＞10μM；消炎痛效應(yīng)：100μM＞50μM＞20μM； (9)20μM塞來昔布或5

11、0μM消炎痛均可顯著抑制PGE2的釋放，抑制率分別為71％和58％；(10)加入外源性PGE2可以劑量依賴性方式阻斷塞來昔布對(duì)Ang-1及-2表達(dá)的抑制，其效應(yīng)10μM＞5μM＞1μM；(11)RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果提示四種EP受體EP1-4在SGC7901細(xì)胞中均有陽性表達(dá)； (12)1μMPGE2可顯著上調(diào)SGC7901細(xì)胞中Ang-1及-2的表達(dá)，10μMEP1和2受體拮抗劑AH-6809可部分抵消這一作用，而10μMEP

12、4受體拮抗劑AH-23848亦有此效應(yīng)； (13)Ep2-4受體激活劑16,16-dimethyl-PGE2可抵消塞來昔布對(duì)Ang-及-2表達(dá)的抑制，而EP1-3受體激活劑17-phenyl-trinor-PGE2效應(yīng)不明顯； (14)缺氧可上調(diào)胃癌細(xì)胞系SGC7901中Ang-2的mRNA及蛋白表達(dá)水平，其表達(dá)水平的變化具有時(shí)相性，在缺氧6h后上調(diào)至常氧下1.75倍，12h達(dá)到高峰至常氧下2.75倍，24h時(shí)仍為正常的

13、2.2倍，而缺氧處理后Ang-1的表達(dá)水平基本保持不變； (15)缺氧處理可顯著增加COX-2的表達(dá)水平，在缺氧2h后表達(dá)即上調(diào)至常氧下1.6倍，6h達(dá)到高峰，至常氧下4.6倍，24h后逐漸降至正常水平；而缺氧對(duì)COX-1的表達(dá)影響不明顯； (16)常氧條件下，SGC7901細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)基本檢測(cè)不到，而缺氧處理后HIF-1α蛋白表達(dá)水平顯著增高；呈時(shí)相性表達(dá)，以6h時(shí)最高，而HIF-1αmRNA表達(dá)基本保持不

14、變； (17)100μMCoCl2處理SGC7901細(xì)胞，可以與缺氧處理類似的模式上調(diào)HIF-1α蛋白的表達(dá)，而Ang-2的表達(dá)也以類似方式增高； (18)genestein可顯著阻斷缺氧處理后HIF-1α的表達(dá)，Ang-2的表達(dá)隨之下降，且抑制效應(yīng)呈劑量依賴性，200μM＞100μM＞50μM； (19)缺氧可顯著上調(diào)SGC7901細(xì)胞培養(yǎng)上清中PGE2的含量(常氧的2.86倍)，缺氧時(shí)加入塞來昔布可顯著降低P

15、GE2水平(P＜0.05)，而SC-560對(duì)缺氧處理細(xì)胞PGE2的合成幾無效應(yīng)； (20)5μM塞來昔布可部分逆轉(zhuǎn)缺氧上調(diào)Ang-2效應(yīng)，而20μM塞來昔布可幾乎完全阻斷缺氧上調(diào)Ang-2表達(dá)，但這種效應(yīng)可被同時(shí)加入5μMPGE2部分抵消；(21)SC-560處理對(duì)缺氧誘導(dǎo)Ang-2效應(yīng)無顯著作用。 結(jié)論: (1)Ang-1、-2及其受體Tie2在胃癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)，其中Ang-1可能與胃癌組織的分化顯著相關(guān)

16、，而Ang-2與胃癌的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)； (2)COX-2可正性調(diào)控Ang-1及-2的表達(dá)水平，抑制COX-2表達(dá)及活性可減弱Ang-1及-2的表達(dá)，這一作用可能通過影響COX-2產(chǎn)物PGE2含量進(jìn)而通過EP2及EP4受體來實(shí)現(xiàn)； (3)缺氧可顯著上調(diào)胃癌細(xì)胞中Ang-2的表達(dá)，而COX-2抑制劑塞來昔布可通過抑制COX-2的表達(dá)及活性從而部分減弱這種作用； (4)轉(zhuǎn)錄因子HIF-1亦可能參

17、與了缺氧上調(diào)Ang-2效應(yīng)； (5)缺氧對(duì)Ang-1表達(dá)幾乎無影響。 總之，本研究探討了Ang-1，-2在胃癌中的表達(dá)及調(diào)節(jié)機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Ang-1，-2及其受體Tie2在胃癌組織及細(xì)胞系中高表達(dá)，并可能參與了胃癌的惡性進(jìn)程。COX-2可能通過調(diào)控Ang-1及-2的表達(dá)，影響其信號(hào)通路，從而發(fā)揮促血管生成作用。缺氧對(duì)Ang-2表達(dá)的調(diào)控涉及HIF-1α及COX-2兩條途徑。這些結(jié)論加深了對(duì)腫瘤血管生成調(diào)控機(jī)制的了解。