IL2、ASGR1和Cav-1在乙型肝炎病毒入胞過(guò)程中的作用.pdf

1、背景：由于缺乏有效的體外乙肝病毒感染的模型，乙肝病毒入胞早期過(guò)程的研究進(jìn)展十分緩慢，在一定程度上影響了乙型肝炎及其相關(guān)肝臟疾病的基礎(chǔ)和臨床研究。越來(lái)越多的研究表明受體在病毒入胞過(guò)程中發(fā)揮了一定的作用。
　　目的：建立一個(gè)HBV體外自然感染HepG2細(xì)胞的模型，探討與HBV入胞相關(guān)的分子和受體。
　　方法：收集HBeAg陽(yáng)性、高拷貝（HBV-DNA>1×108copies/ml）乙肝病人血清；未注射過(guò)乙肝疫苗的乙肝兩對(duì)半全陰的

2、正常人血清；以及2.2.15細(xì)胞上清。用PEG沉淀和蔗糖密度梯度離心得到去除病毒的高拷貝病人血清和2.2.15細(xì)胞病毒顆粒。將高拷貝血清和2.2.15細(xì)胞的病毒混合物作為實(shí)驗(yàn)組，正常人血清和2.2.15細(xì)胞的病毒混合物作為陰性對(duì)照組，和HepG2細(xì)胞共孵育，用DMSO處理六天的HepG2細(xì)胞加實(shí)驗(yàn)組血清作為陽(yáng)性對(duì)照組。24h后去除舊培養(yǎng)基，PBS清洗3次，胰酶消化重懸繼續(xù)孵育。收集去感染后細(xì)胞上清和細(xì)胞。ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中的H

3、BsAg，PCR方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中的HBVDNA，電鏡觀察細(xì)胞上清中的病毒顆粒，組織化學(xué)、共聚焦和western blot觀察細(xì)胞中的HBcAg。然后利用抗體中和方法中和血清中的IL-2，IL-12，定量PCR觀察進(jìn)入細(xì)胞的HBcAg的mRNA。用RNA干擾降低HepG2細(xì)胞表面的ASGR1或者CAV-1含量，PCR、western blot方法觀察細(xì)胞內(nèi)HBcAg含量。
　　結(jié)果：HBV高拷貝血清作為實(shí)驗(yàn)組自然感染的HepG

4、2細(xì)胞上清中，ELISA檢測(cè)到HBsAg并且持續(xù)到120h，PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞上清中的HBV DNA呈陽(yáng)性，免疫電鏡可以觀察到細(xì)胞培養(yǎng)上清中Dane樣顆粒和20nm左右的桿狀顆粒和球形顆粒。共聚焦、組織化學(xué)、Western Blot觀察到細(xì)胞內(nèi)的HBsAg和HBcAg。用抗體中和血清中IL-2后RT-PCR方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi) HBcAg mRNA發(fā)達(dá)也減低。RNA干擾細(xì)胞膜上的ASGR1和cav-1后，用RT-PCR和WB檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)H