模擬日光照射后皮膚屏障損傷與真菌感染的相關(guān)性研究.pdf

1、真菌感染疾病是皮膚科臨床中最常見的疾病之一，占皮膚科總門診量的50％左右。近年來隨著抗生素和免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用、腫瘤、艾滋病、器官移植的增加以及環(huán)境的惡化，真菌感染的發(fā)病率逐年增高，其中環(huán)境因素已成為多種疾病發(fā)生和加重的重要因素。由于臭氧層的破壞，地球表面紫外線輻射量增加，使得紫外線的危害更加嚴(yán)重。紫外線對(duì)各種疾病如細(xì)菌、病毒感染及腫瘤等疾病的影響已有大量研究報(bào)道，但紫外線對(duì)真菌感染的影響仍未明確。
　　 環(huán)境中紫外線包括UV

2、A(320～400nm)、UVB(280～320nm)、UVC(＜280nm)。目前，關(guān)于紫外線的研究大多集中于UVA和UVB，關(guān)于UVC的研究報(bào)道甚少。UVA和UVB對(duì)皮膚影響包括引起紅斑、色素沉著、物理結(jié)構(gòu)損害及免疫損傷等，但兩者引起皮膚光損傷的臨床表現(xiàn)及機(jī)制可能存在差異，至今仍無詳盡文獻(xiàn)報(bào)道。
　　 真菌是真核生物，從傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)上可分為酵母相和菌絲相。目前已發(fā)現(xiàn)致病真菌約400多種。多數(shù)真菌在環(huán)境中普遍存在，并可熟練感知周

3、圍環(huán)境變化，產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)從而促進(jìn)其在惡劣多變的環(huán)境中生存。這一特性促使它們可與植物、動(dòng)物或人等宿主發(fā)生相互作用，形成共棲狀態(tài)、潛伏感染或致病狀態(tài)。
　　 真菌感染的發(fā)生除了真菌自身毒力因素的作用外，宿主防御系統(tǒng)也對(duì)其有重要影響，并決定著真菌感染的轉(zhuǎn)歸和預(yù)后。作為機(jī)體的首道防御屏障，皮膚的屏障功能有廣義與狹義之分。廣義的皮膚屏障不僅包括皮膚的物理屏障作用，還包括皮膚的免疫屏障、色素屏障、神經(jīng)屏障等;狹義皮膚屏障指皮膚的完整性結(jié)構(gòu)

4、，尤其是角質(zhì)層與其間脂質(zhì)構(gòu)成的“磚墻結(jié)構(gòu)”。皮膚屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)主要是角質(zhì)層、脂質(zhì)和多種天然保濕因子。此外，表皮各種蛋白質(zhì)、無機(jī)鹽等也是其重要組成部分。表皮脂質(zhì)包括神經(jīng)酰胺、(.)豐富的磷脂、游離膽固醇及不飽和脂肪酸等，這些脂質(zhì)在基底細(xì)胞向角質(zhì)層分化過程中含量逐漸增高，到達(dá)角質(zhì)層時(shí)從細(xì)胞間隙排出，形成防止水分丟失的屏障。天然保濕因子是由表皮中間絲相關(guān)蛋白分解而成，對(duì)保持皮膚水合作用有重要意義，常見的天然保濕因子包括某些氨基酸、吡咯烷酮羧酸

5、、尿刊酸、尿素等多種低分子物質(zhì)。免疫屏障包括以T細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等為主的細(xì)胞水平免疫，同時(shí)還包括以各種細(xì)胞因子、腫瘤壞死因子、尿刊酸、抗微生物肽等為主的分子水平免疫。
　　 迄今為止，已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道紫外線對(duì)皮膚屏障的影響，及紫外線照射對(duì)皮膚發(fā)生細(xì)菌、病毒感染及腫瘤等的影響，但對(duì)真菌感染影響的研究較少;并且多數(shù)實(shí)驗(yàn)研究UVA、UVB的單獨(dú)作用及其機(jī)制。但環(huán)境中紫外線是UVA與UVB以一定比例聯(lián)合

6、照射，從而影響皮膚屏障功能。因此，本研究利用SUV-1000日光紫外線模擬器作為光源，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)后選擇適合的動(dòng)物作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，選取親動(dòng)物性致病真菌中最常見的須癬毛癬菌為實(shí)驗(yàn)菌株，構(gòu)建不同劑量紫外線照射后皮膚日曬傷模型，并檢測(cè)皮膚屏障改變從而研究模擬日光導(dǎo)致皮膚屏障損傷的機(jī)制。同時(shí)構(gòu)建紫外線照射后須癬毛癬菌感染模型，進(jìn)一步研究紫外線照射后皮膚屏障損傷與真菌感染的相關(guān)性和相關(guān)機(jī)制，以期為創(chuàng)傷性真菌感染的防治研究提供基礎(chǔ)。
　　 第一章

7、，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物最小紅斑量(minimalerythemadoseMED)的測(cè)定
　　 1.目的:
　　 分別檢測(cè)豚鼠、C57BL/6、ICR小鼠的最小紅斑量，并確定何種為本實(shí)驗(yàn)最適實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。
　　 2.方法:
　　 利用SUV-1000日光模擬器作為光源，MED測(cè)定器被分為劑量依次遞減的8個(gè)照射孔，每次照射前利用UVA、UVB輻照計(jì)測(cè)出光源輸出功率。豚鼠10只，每只照射1組（即8個(gè)）光斑劑量;C57BL/6、

8、ICR小鼠分別30只，分別每3只為1組，每只依次照射2個(gè)光斑，即1組6個(gè)光斑劑量。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物備皮，照射時(shí)固定于模擬日光照射儀光源下，使皮膚緊貼照射孔，同時(shí)遮蔽眼睛使其免于模擬日光照射。豚鼠8孔照射劑量范圍UVA約為160～2500mJ/cm2，UVB約為15～200mJ/cm2，由小到大以約1.414倍遞增;C57BL/6、ICR小鼠6個(gè)光斑照射范圍UVA約為100～1800mJ/cm2，UVB約為10～160mJ/cm2，由小到大以約

9、1.414倍遞增。照射后觀察48小時(shí)內(nèi)各組小鼠皮膚紅斑反應(yīng)情況，以照射后24小時(shí)各組出現(xiàn)可見紅斑的最小照射劑量為各組最小紅斑量，三種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物最小紅斑量分別求均值，記為三種鼠的最小紅斑量。
　　 3.結(jié)果:
　　 模擬日光照射后計(jì)算三種鼠的最小紅斑量，C57BL/6小鼠UVA498mJ/cm2，UVB42mJ/cm2，總劑量540mJ/cm2;ICR小鼠UVA644.9mJ/cm2，UVB55.4mJ/cm2,總劑量700

10、.3mJ/cm2;豚鼠UVA1430mJ/cm2，UVB122mJ/cm2，總劑量1552mJ/cm2。綜合考慮模擬日光照射操作方式、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物備皮處理的影響及后期真菌感染實(shí)驗(yàn)操作等因素，選取豚鼠為本實(shí)驗(yàn)的最適實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。
　　 第二章，模擬日光照射后豚鼠皮膚屏障損傷及其與真菌感染相關(guān)性分析
　　 1.目的:
　　 構(gòu)建模擬日光照射導(dǎo)致皮膚光損傷動(dòng)物模型及光損傷后須癬毛癬菌感染動(dòng)物模型，研究模擬日光照射與皮膚屏障損傷

11、及其與須癬毛癬菌感染的關(guān)系。
　　 2.方法:
　　 (1)模擬日光照射及照射后真菌感染
　　 利用SUV-1000日光紫外線模擬器照射豚鼠背部皮膚，測(cè)出其MED后。將70只實(shí)驗(yàn)豚鼠分為5組，第1、2、3、4組分別以0MED、0.5MED、1MED、4MED連續(xù)3天照射其背部備皮后皮膚，每次照射前重新備皮。連續(xù)3天照射完成后次日，每組隨機(jī)抽取6只檢測(cè)其皮膚屏障改變。完畢后將預(yù)先制備的須癬毛癬菌懸液均勻涂抹于每組剩

12、余豚鼠照射部位皮膚。第5組為空白對(duì)照組，脫毛后不進(jìn)行照射，背部涂抹生理鹽水以做對(duì)照。自然晾干后放置于籠中單獨(dú)飼養(yǎng)，自接種之日起觀察豚鼠背部皮膚臨床表現(xiàn)的變化，為期28天，出現(xiàn)紅斑、脫屑、結(jié)痂、糜爛各計(jì)為1分，同時(shí)出現(xiàn)多種臨床表現(xiàn)時(shí)分?jǐn)?shù)累加。
　　 (2)照射后皮膚屏障檢測(cè)
　　 各組分別照射完畢后次日，每組分別隨機(jī)抽取6只，10％烏拉坦麻醉后于照射部位用皮膚鉆孔器取全層皮膚，10％多聚甲醛固定，石蠟包埋切片后行HE染色及

13、CD4+、CD8+T細(xì)胞抗體染色。同時(shí)取豚鼠背部皮膚引流淋巴結(jié)，即腹股溝淋巴結(jié)，10％多聚甲醛固定，石蠟包埋切片后行HE染色及CD4、CD8抗體染色。
　　 (3)真菌感染鑒定
　　 真菌感染鑒定方法采用真菌鏡檢、真菌培養(yǎng)和組織病理方法。真菌直接鏡檢和培養(yǎng)于接種后4日開始，刮取豚鼠背部皮屑及毛發(fā)，進(jìn)行顯微鏡下10％氫氧化鉀常規(guī)鏡檢，并留取少量皮屑及毛發(fā)，接種于含氯霉素和放線菌酮的SDA培養(yǎng)基上，每隔4天進(jìn)行一次，至感染后

14、第28天，觀察皮膚及毛發(fā)真菌感染情況。真菌培養(yǎng)后7～10天，觀察培養(yǎng)菌落形態(tài)，并利用無菌接種針挑取少許培養(yǎng)菌落進(jìn)行乳酸酚棉蘭染色和PDA小培養(yǎng)，顯微鏡下鑒定。接種后第10天，每組豚鼠中隨機(jī)抽取2只處死，于感染部位取皮膚全層組織進(jìn)行PAS染色，進(jìn)一步鑒定感染結(jié)果。
　　 (4)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。1、2、3、4組感染后評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示。多組比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)資

15、料的方差分析，若數(shù)據(jù)滿足球形檢驗(yàn)，結(jié)果不需要校正;若不滿足球形檢驗(yàn)，則采用校正的Greenhouse-Geisser法。兩兩組間比較采用LSD檢驗(yàn)。各組評(píng)分-時(shí)間曲線下面積、最初感染時(shí)間和到達(dá)最高分值時(shí)間以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較，若方差齊同采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊采用Tamhane'sT2檢驗(yàn)。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3.結(jié)果:
　　 感染后大體改變:

16、第5組空白對(duì)照組未發(fā)生感染變化，第3、4于接種后3天即出現(xiàn)皮膚紅斑反應(yīng)，第2組接種后第4天出現(xiàn)紅斑，第1組空白感染組接種后第5天開始出現(xiàn)皮膚紅斑反應(yīng)。感染中期，同一天各組豚鼠皮損第4組臨床表現(xiàn)較1、2、3組明顯嚴(yán)重。第1、2組于感染后21出現(xiàn)個(gè)別豚鼠皮損恢復(fù)，表現(xiàn)為痂皮脫落，遺留紅斑及少量脫屑;第3、4組感染后皮損于23天始逐漸恢復(fù)。對(duì)感染過程中各組豚鼠皮損評(píng)分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示:4組評(píng)分組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.049)。4組

17、評(píng)分組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，第4組皮損評(píng)分與1、2組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.022、0.037），第4組與第3組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.108)，第1、2、3三組之間兩兩比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1、2組比較P=0.747，1、3組比較P=0.377，2、3組比較P=0.503）。4組曲線下面積組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.070)，最初感染時(shí)間組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.066)，達(dá)到最高分值的時(shí)間無統(tǒng)計(jì)

18、學(xué)差異(P=0.729)。
　　 皮膚屏障功能檢測(cè)結(jié)果表明，照射后可見不同程度物理屏障損傷，并隨照射劑量增加呈現(xiàn)加重趨勢(shì)。皮膚CD4+、CD8+T細(xì)胞免疫組化染色，第1組未照射組背部皮膚和淋巴結(jié)中均可見CD4表達(dá)和CD8少量表達(dá)。第2、3、4組皮膚和淋巴結(jié)中CD4表達(dá)強(qiáng)度均較第1組下降，CD8表達(dá)強(qiáng)度有增加的趨勢(shì)。
　　 真菌檢查結(jié)果顯示第1、2、3、4組豚鼠真菌全部為陽(yáng)性，第5組空白對(duì)照組未見真菌感染。第1～4組豚鼠于

19、接種須癬毛癬菌后第4天刮取背部皮屑，直接鏡檢結(jié)果全部陽(yáng)性，培養(yǎng)結(jié)果通過觀察菌落形態(tài)、乳酸酚棉蘭染色及小培養(yǎng)鑒定全部為須癬毛癬菌。第1～4組豚鼠皮膚組織切片PAS染色鏡下可見角質(zhì)層、毛根及毛干內(nèi)大量孢子及少量菌絲分布，染成深紅色，第5組未見菌絲及孢子。
　　 結(jié)論:
　　 1.豚鼠、C57BL/6、ICR小鼠三種動(dòng)物最小紅斑量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，豚鼠更適合模擬日光照射后真菌感染實(shí)驗(yàn)。其優(yōu)點(diǎn)在于:背部面積較大，可8孔光斑同時(shí)照射在

20、一只豚鼠上，減少最小紅斑量誤差;采用硫化鋇脫毛，對(duì)皮膚的損傷較小;性情溫和，模擬日光照射時(shí)便于操作;其背部皮膚更易接種真菌，并且便于觀察感染后臨床表現(xiàn)。
　　 2.以大于或等于最小紅斑量的模擬日光照射后，豚鼠皮膚可發(fā)生日曬紅斑反應(yīng)，小于最小紅斑劑量照射不出現(xiàn)紅斑反應(yīng);模擬日光照射后皮膚屏障發(fā)生明顯損傷，并且在一定照射范圍內(nèi)隨劑量增加皮膚損傷呈加重趨勢(shì);模擬日光照射劑量對(duì)真菌感染的發(fā)生率無影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示照射組和非照射組豚鼠感染