PAF-AH單核苷酸多態(tài)性及其酶活性與銀屑病相關(guān)性探討.pdf

1、血小板活化因子 (platelet-activating factor，PAF)是由多種炎癥細胞、血小板及血管內(nèi)皮細胞等產(chǎn)生的一種高生理活性磷脂，具有廣泛的生物學(xué)活性，同時又是一種強效炎癥介質(zhì)，對炎癥反應(yīng)起著重要的調(diào)控作用，與多種疾病的病理生理有關(guān)。PAF乙酰水解酶(PAF acetylhydrolase，PAF-AH)屬于磷脂酶A2家族，通過降解PAF，調(diào)控其在體內(nèi)的水平，從而阻斷PAF介導(dǎo)的生理病理學(xué)作用。PAF-AH的編碼基因被考

2、慮為炎癥性疾病，尤其是某些特應(yīng)性疾病和自身免疫性疾病的易感基因。 國內(nèi)外學(xué)者對PAF-AH參與疾病的相關(guān)機制進行了大量研究，證實在PAF-AH的DNA序列中存在導(dǎo)致酶生物學(xué)性質(zhì)改變的單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotidepolymorphism，SNP)，如：Arg92His，Ilel98Thr，Val279Phe，Gin281Arg及Val379Ala等，這些突變與哮喘、特應(yīng)性皮炎、敗血癥、腦梗塞、心血管疾病等密切

3、相關(guān)。根據(jù)PAF-AH的結(jié)構(gòu)分析這些SNPs對酶活性影響的機制可能在于：Val279Phe和Gln281Arg位于該酶活性中心Ser-273和Asp-296殘基之間，因此對其正確折疊至關(guān)重要。Ile198Thr位于Tyr-205附近，由于PAF的水解由PAF-AH與LDL結(jié)合型完成，而Tyr-205對PAF-AH與LDL 的結(jié)合緊密相關(guān)，故該突變可影響PAF的降解。Val379Ala位點接近His-351，該位點為脂酶活性三聯(lián)體之一，故

4、該突變可影響酶活性。以上導(dǎo)致血漿型PAF-AH失活的基因損害的明確，向研究該酶在疾病中的作用邁出了重要的一步。 銀屑病是一種常見的慢性炎癥性疾病，其發(fā)病機制復(fù)雜，炎性細胞和炎癥介質(zhì)異常在該病的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用。PAF及其拮抗劑PAF-AH作為炎癥系統(tǒng)中的重要分子，與銀屑病的關(guān)系也日益受到學(xué)者們的關(guān)注。Izaki等發(fā)現(xiàn)銀屑病皮損的鱗屑中包含大量的PAF，銀屑病患者外周血血漿中PAF水平顯著高于健康對照組，治療后銀屑病患者P

5、AF水平降低，并且與病情的進展，包括皮損范圍以及嚴重度(PASI)相關(guān)。而在我們的前期實驗中，發(fā)現(xiàn)中國人群銀屑病患者的血漿PAF-AH活性顯著低于健康對照組，并且進展期酶活性低于靜止期和消退期，而后兩期的酶活性相當(dāng)，提示PAF-AH 酶活性不足可能是銀屑病發(fā)生、發(fā)展的一個影響因素，可能與病情活動性有一定相關(guān)性。在該酶各SNP的研究中，檢測到與銀屑病患者酶活性相關(guān)的SNP，并可能導(dǎo)致銀屑病患者血漿PAF-AH酶活性的改變，提示PAF-AH

6、的某些基因改變可能在銀屑病的發(fā)病機制中發(fā)揮一定作用。 鑒于酶活性受多種因素的影響，給研究工作帶來一定的制約。因此，進一步從分子生物學(xué)的角度，原核表達野生型及含各SNPs的PAF-AH，得到功能性的純化蛋白，對其生物學(xué)活性進行研究，從而分析各特異性SNPs對PAF-AH活性的影響，為探討其與銀屑病的相關(guān)性提供理論依據(jù)。 第一部分血漿型PAF-AH原核表達載體的構(gòu)建 本部分實驗利用基因重組技術(shù)，構(gòu)建血漿型PAF-AH

7、的原核表達載體，為后續(xù)實驗提供技術(shù)平臺。 提取正常人外周血單個核細胞(PBMC) RNA，RT-PCR擴增出人血漿PAF-AH的全長基因片段，連接入克隆載體pMD18-T，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109后測序鑒定。獲得正確序列后再連接入表達載體pGEX-4T-3，轉(zhuǎn)化宿主菌BL21。采用重疊PCR的方法，以野生型PAF-AH全長基因為模板，通過3步。PCR得到含特異點突變的基因，轉(zhuǎn)入所構(gòu)建的表達載體。 瓊脂糖凝膠電泳證實獲得了血

8、漿型PAF-AH的全長基因，測序結(jié)果與Genbank中一致，酶切鑒定表明基因片段成功接入克隆載體及表達載體。得到了Arg92His，Ile198Thr，Val279Phe，Gln281Arg及Val379Ala基因突變的PAF-AH，經(jīng)測序定點突變成功，其余序列分析與GenBank數(shù)據(jù)庫中一致。 通過本部分實驗，構(gòu)建了野生型及各SNPs的PAF-AH原核表達載體，為后續(xù)蛋白表達提供了主體，也為進一步研究該蛋白的活性及與銀屑病相關(guān)

9、性奠定了基礎(chǔ)。 第二部分 PAF-AH融合蛋白的表達、純化及鑒定 在前一部分基礎(chǔ)上，將各型SNP的PAF-AH蛋白在原核細胞中誘導(dǎo)表達并純化，獲得高純度的具有生物學(xué)活性的PAF-AH蛋白。 采用IPTG誘導(dǎo)表達各型SNP，的PAF-AH原核表達載體，優(yōu)化誘導(dǎo)表達條件，所得表達蛋白用GST親和層析系統(tǒng)進行純化，融和蛋白以 Thrombin切割得到各型PAF-AH蛋白。 誘導(dǎo)表達蛋白經(jīng)超聲裂菌，取各型PAF-

10、AH-GST融合蛋白表達菌液及上清進行SDS-PAGE，均可在約72KD處見蛋白條帶，與預(yù)期大小一致。經(jīng)純化后以SDS-PAGE檢測PAF-AH-GST融合蛋白及PAF-AH蛋白，可分別與72KD及44KD處見目的條帶。用PAF-AH多克隆抗體進行Western-blot免疫學(xué)檢測，也可于相應(yīng)分子量大小處見蛋白印跡。 通過該部分實驗，表達得到可溶性的融和蛋白，并純化得到高純度的各型PAF-AH蛋白，為進一步研究其酶動力學(xué)特性及潛

11、在的生理功能打下了基礎(chǔ)。 第三部分各SNIPs型的PAF-AH活性分析及其與銀屑病的相關(guān)性探討 本部分實驗擬通過酶動力學(xué)指標(biāo)檢測，分析各特異性SNPs對PAF-AH活性的影響，并探討其與銀屑病的相關(guān)性。 取第二部分中表達純化的蛋白，以Bradford法定量。以2-硫代PAF作為PAF-AH的底物，檢測其活性。稀釋蛋白至適當(dāng)濃度，以六個底物濃度梯度：10/20/40/60/80/100uM，檢測反應(yīng)體系在405nm

12、的吸光度變化，得到各個蛋白在該條件下對不同濃度底物的反應(yīng)速度。應(yīng)用Lineweaver-Burk作圖法(雙倒數(shù)圖)計算得出各酶的Km值和該條件下的Vmax。從而比較野生型PAF-AH和各特異性SNPs的PAF-AH活性。 酶動力學(xué)結(jié)果表明：Va1279Phe型PAF-AH酶活性完全喪失：Ile198Thr及Va1379Ala型Km值分別為野生型的4倍和2倍左右，酶活性明顯下降；Arg92His及Gin281Arg型Km值分別為野

13、生型的1.3倍和1.5倍左右，酶活性僅輕度下降。 本部分實驗證實Va1279Phe型SNP對PAF-AH的酶活性有關(guān)鍵性影響，該點氨基酸的改變可致酶活性完全喪失；Ile198Thr及Va1379Ala型SNP對酶活性非常重要，該點的改變可致酶活性明顯降低；Arg92His及Gln281Arg對酶活性影響不顯著。 本課題構(gòu)建了PAF-AH的表達載體并純化得到具有生物學(xué)活性的蛋白，證實了各SNPs對酶活性有不同程度的影響，甚