西妥昔單抗抑制胰腺癌細(xì)胞株增殖及機(jī)制研究.pdf

1、目的:胰腺癌是一種惡性度極高的消化系統(tǒng)腫瘤之一，具有進(jìn)展快、不宜早期發(fā)現(xiàn)和診治，導(dǎo)致臨床有效率和預(yù)后極差。由于胰腺解剖位置、胰腺癌生物學(xué)習(xí)性、早期缺乏明顯的臨床特異癥狀、體征，并且缺少簡便可靠的早期診斷手段，極易侵犯周圍組織器官及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，臨床確診時已屬晚期，因此，不能早期診治，預(yù)后差，嚴(yán)重影響患者生命。為此，研究者通過大量臨床研究表明，早期治療以手術(shù)切除為主，同時聯(lián)合化療、放療及免疫治療等的綜合治療，以期達(dá)到早期診治、提高療效，延長無

2、病生存期等方面，起到了一定的作用。
　　隨著國內(nèi)外學(xué)者對癌癥的分子、細(xì)胞誘因的不斷發(fā)現(xiàn)和認(rèn)識，癌細(xì)胞的異常特征能被發(fā)現(xiàn)，為癌癥靶點治療提供了理論依據(jù)。其中人表皮生長因子受體1(EGFR、HER-1、Erbb-、v-erb-b2erythrobl-astic leukemiaviral oncogene homolog1)，是一種在癌細(xì)胞中被頻繁異常調(diào)節(jié)的跨膜糖蛋白，分子量為170KD，由一個胞外區(qū)，一個疏水跨膜區(qū)域和一個含酪氨酸激

3、酶結(jié)構(gòu)域的胞內(nèi)區(qū)組成。胞外區(qū)為EGF提供配體結(jié)合區(qū)，并轉(zhuǎn)化生長因子-a(TGF-a)，當(dāng)細(xì)胞間域在配體結(jié)合時被激活，EGF介導(dǎo)的酪氨酸激酶信號傳導(dǎo)通路打開。通常在正常組織和惡性腫瘤組織里都有表達(dá)，參與細(xì)胞的信號傳導(dǎo)。研究文獻(xiàn)已證實在胰腺癌中EGFR存在過表達(dá)，與疾病的預(yù)后、生存率較低以及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)[1]。已知西妥昔單抗是一種針對EGFR的特異性單克隆抗體，可與表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子α競爭性結(jié)合多種腫瘤細(xì)胞表面的EGFR，從而阻斷E

4、GF、TGF-α等配體對EGFR的酪氨酸磷酸化作用，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。臨床上已廣泛應(yīng)用西妥西單抗治療K-RAS野生型的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌和頭頸部惡性腫瘤，并取得較好的療效[2-4]。我們推測抑制表皮生長因子受體的信號傳導(dǎo)通路是治療胰腺癌的新方法，因此，本課題擬通過MTT和流式細(xì)胞技術(shù)方法，應(yīng)用西妥昔單抗對人胰腺癌細(xì)胞的抗腫瘤作用及信號通路機(jī)制進(jìn)行研究，為西妥昔單抗在胰腺癌的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　方法:1應(yīng)用MTT方

5、法，對人胰腺癌細(xì)胞株SW1990、PANC-1，分別應(yīng)用西妥昔單抗在不同濃度(12.5ug/ml，25ug/ml，50ug/ml，100ug/ml)，不同作用時間(24h、48h、72h)時的抗腫瘤作用探討。用顯微鏡觀察西妥昔單抗干預(yù)后胰腺癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，測得西妥昔單抗對胰腺癌細(xì)胞株抑制率;應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)同樣檢測西妥昔單抗對胰腺癌細(xì)胞株細(xì)胞周期、凋亡的影響。
　　2通過Western Blot方法，應(yīng)用最佳作用濃度和作用時間西

6、妥昔單抗對人胰腺癌細(xì)胞株SW1990、PANC-1的Wnt/β-catenin、EGFR信號通路中的關(guān)鍵蛋白EGFR、β-catenin進(jìn)行檢測，探討西妥昔單抗抑制胰腺癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制。
　　結(jié)果:1MTT方法檢測西妥昔單抗對人胰腺癌細(xì)胞株的抑制率:不同濃度西妥昔單抗24小時作用胰腺癌細(xì)胞株SW1990、PANC-1抑制率分別為70.9％、86.6％、114.9％、142.4％和53.9％、65.9％、99.4％、108.

7、3％;48小時作用胰腺癌細(xì)胞株SW1990、PANC-1抑制率分別為-22.8％、7.3％、54.2％、63.1％和-14.3％、26.7％、60.8％、76.3％;72小時作用胰腺癌細(xì)胞株SW1990、PANC-1抑制率分別為-14.2％、26.7％、60.8％、76.3％和-20.0％、1.8％、40.0％、61.8％;得出:隨著西妥昔單抗12.5ug/ml，25 ug/ml，50ug/ml，100ug/ml濃度的增加，胰腺癌細(xì)胞株

8、抑制率增高;隨著不同作用時間24h，48h，72h，顯示24小時最高抑制率。得出:西妥昔單抗在100ug/ml、24小時對胰腺癌細(xì)胞株SW1990、PANC-1最高抑制率，應(yīng)用此藥物濃度和作用時間進(jìn)行后續(xù)機(jī)制研究。
　　流式細(xì)胞技術(shù)檢測結(jié)果顯示，胰腺癌細(xì)胞SW1990、PANC-1經(jīng)西妥昔單抗100ug/ml處理24小時后，收集細(xì)胞。給予PI染色，流式細(xì)胞儀檢測。結(jié)果顯示西妥昔單抗組G0/G1期細(xì)胞比例增加，S期細(xì)胞比例減少，提示

9、西妥昔單抗可通過改變細(xì)胞周期抑制細(xì)胞增殖。
　　2應(yīng)用Western Blot方法，檢測西妥昔單抗100ug/ml、24小時干預(yù)胰腺癌細(xì)胞株SW1990、PANC-1后，β-catenin、EGFR蛋白的表達(dá)水平均明顯低于對照組，提示西妥昔單抗可能通過抑制β-catenin、EGFR蛋白阻斷Wnt/β-catenin、EGFR，抑制胰腺癌細(xì)胞株的增殖。
　　結(jié)論:1西妥昔單抗最佳作用濃度和作用時間:在100ug/ml、24小