Orexin在大鼠視網(wǎng)膜中的表達(dá)及對(duì)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞上L型鈣電流的調(diào)制.pdf

1、Orexin(又稱為hypocretin)是一類神經(jīng)活性肽，包括orexin-A(hypocretin-1)和orexin-B(hypocretin-2)，它們分別含有33和28個(gè)氨基酸殘基，由共同前體prepro-omxin經(jīng)水解產(chǎn)生。Orexin通過與質(zhì)膜上G蛋白偶聯(lián)的特異性受體:orexin-1型受體(OX1R)和orexin-2型受體(OX2R)結(jié)合而發(fā)揮作用。在腦中，產(chǎn)生和分泌orexin的神經(jīng)元特異地分布于下丘腦側(cè)后部，并廣

2、泛投射至全腦。Orexin參與多種生理作用的調(diào)控，例如睡眠/覺醒、晝夜節(jié)律、神經(jīng)元的放電、攝食行為等。然而，對(duì)這種調(diào)節(jié)肽在視網(wǎng)膜中的研究卻基本上屬于空白。唯一的工作顯示，人的視網(wǎng)膜神經(jīng)元表達(dá)orexin-A和orexin-B，但作者并未用免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)這些神經(jīng)元的細(xì)胞類型。
　　本文研究了orexin及其受體在大鼠視網(wǎng)膜各類細(xì)胞上的分布;并進(jìn)一步研究了orexin-A對(duì)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(ganglion cell，GC)上L型鈣電流的

3、調(diào)制作用及其機(jī)制。運(yùn)用RT-PCR及免疫組化方法，我們的結(jié)果顯示orexin及OX1R和OX2R的mRNA和蛋白均存在于大鼠視網(wǎng)膜中。Orexin-A和B的免疫熒光染色在內(nèi)核層和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層的許多細(xì)胞上可見。免疫雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)顯示，在外層視網(wǎng)膜，orexin-A和B表達(dá)在calbindin標(biāo)記的水平細(xì)胞和homeobox protein Chx10標(biāo)記的雙極細(xì)胞上。在內(nèi)層視網(wǎng)膜，orexin-A和B均表達(dá)在GABA能無長(zhǎng)突細(xì)胞（amacrin

4、e cell，AC）上，包括酪氨酸羥化酶標(biāo)記的多巴胺能AC和膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶標(biāo)記的膽堿能AC上。甘氨酸能AC（包括AⅡ型AC）也表達(dá)這兩種肽。此外，orexin-A和B在所有cholera toxin B(CTB)逆行標(biāo)記的GC上也有明顯表達(dá)。OX1R表達(dá)在大部分GC和多巴胺能AC上，并在兩個(gè)網(wǎng)狀層上也有彌散的分布。與之形成對(duì)照的是，在大鼠視網(wǎng)膜中未檢測(cè)到明顯的OX2R的免疫熒光染色。這些結(jié)果提示，orexin可能參與調(diào)節(jié)內(nèi)層視網(wǎng)膜神經(jīng)

5、元的功能。應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗記錄技術(shù)，在大鼠視網(wǎng)膜薄片上，我們首先鑒定了L型鈣電流。在細(xì)胞外液中，用5 mM Ba2+取代Ca2+，并施加TTX、TEA分別阻斷電壓門控鈉通道和非選擇性鉀通道，將細(xì)胞鉗制于-40 mV，去極化到0 mV，引出內(nèi)向電流，此電流可被L型鈣通道特異性激動(dòng)劑BayK8644增大，并能被L型鈣通道特異性阻斷劑nifedipine阻斷。接著，我們進(jìn)一步研究了orexin-A對(duì)GC上L型鈣電流的調(diào)制作用。結(jié)果顯示，ore

6、xin-A能顯著增大L型鈣電流，并能被洗回。當(dāng)胞外給予OX1R特異性阻斷劑SB334867時(shí)可取消orexin-A對(duì)L型鈣電流的增大作用，而OX2R特異性阻斷劑TCS OX229則沒有作用，表明orexin-A對(duì)L型鈣電流的調(diào)制作用經(jīng)由OX1R介導(dǎo)。L型鈣通道的激活和穩(wěn)態(tài)失活均不受orexin-A的影響。
　　本文研究了orexin-A增大L型鈣電流的胞內(nèi)機(jī)制。胞內(nèi)施加G蛋白抑制劑GDP-β-S后，orexin-A不再增大L型鈣電

7、流，提示G蛋白參與上述作用。磷脂酰肌醇磷脂酶C(phosphatidylinositol phospholipase C，PI-PLC)抑制劑U73122可明顯減弱orexin-A的作用，而磷脂酰膽堿磷脂酶C(phosphatidylcholine phospholipase C，PC-PLC)抑制劑D609卻不起作用。此外，胞內(nèi)施加10 mM BAPTA使細(xì)胞處于Ca2+-free條件下，再施加orexin-A，作用消失，說明orex

8、in-A的作用有胞內(nèi)鈣的參與。當(dāng)給予xestospongin-C(XeC)或肝素（heparin）阻斷IP3受體介導(dǎo)的鈣庫釋放，orexin-A的作用消失，而胞內(nèi)給予ryanodine阻斷ryanodine受體介導(dǎo)的鈣庫釋放，orexin-A仍能增大L型鈣電流。因此，orexin-A增大L型鈣電流依賴于IP3受體介導(dǎo)的胞內(nèi)鈣庫釋放Ca2+。L型鈣電流的增大也可被蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)抑制劑bisindol

9、ymeleimideⅣ(BisⅣ)和G?6976所阻斷。然而，蛋白激酶A(proteinkinaseA，PKA)抑制劑KT5720或激動(dòng)劑cAMP和蛋白激酶G(protein kinaseG，PKG)抑制劑KT5823或激動(dòng)劑cGMP均不影響orexin-A對(duì)GC上L型鈣電流的增大作用。研究了orexin-A和B及其受體在大鼠視網(wǎng)膜上的分布，并進(jìn)一步顯示orexin-A與GC胞膜上的OX1R結(jié)合后，激活G蛋白/PI-PLC/IP3/Ca