基于抗原抗體相互作用的立體結(jié)構(gòu)信息設(shè)計新型TNF-α拮抗分子.pdf

1、TNF-α的過量表達(dá)與很多疾病密切相關(guān)，應(yīng)用TNF-α的拮抗劑部分阻斷這些疾病中的TNF-α水平，將成為一種有效的治療措施。已開發(fā)的TNF-α拮抗劑主要包括兩大類，即TNF受體與IgG的FC段形成的融合蛋白和抗TNF-α的單抗，國外已有成熟產(chǎn)品上市。開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的TNF-α拮抗分子具有重要的理論和實(shí)際意義。 本論文擬根據(jù)構(gòu)建的TNF-α與本實(shí)驗(yàn)室獲得的鼠源功能性單抗Z12相互作用的復(fù)合物模型合理設(shè)計得到的低親和力拮抗肽，

2、借助建立的基于抗原—抗體相互作用結(jié)構(gòu)信息設(shè)計抗體模擬物的技術(shù)平臺，創(chuàng)造性地提出了三種提高TNF-α拮抗分子生物學(xué)活性的技術(shù)：(1)將設(shè)計的短肽通過Linker與人IgG1的FC段連接后構(gòu)建成的免疫黏附分子(短肽-Linker-FC)；(2)利用人抗體重鏈可變區(qū)(VH)的框架結(jié)構(gòu)作為支架，同時展示三條短肽，設(shè)計成新型分子PTVH5；(3)優(yōu)化TNF-α與Z12的復(fù)合物模型，設(shè)計活性提高的短肽。具體研究結(jié)果如下： (1)針對設(shè)計的T

3、NF-α拮抗肽(PT1～PT4)，選擇抑制TNF-α細(xì)胞毒性效果最好的PT4，利用Linker將其與人IgG1的FC段連接，構(gòu)建成PT4-Linker-FC融合蛋白，提高了PT4熱力學(xué)穩(wěn)定性。所構(gòu)建的融合蛋白能夠競爭抑制HRP標(biāo)記的Z12與TNF-α的結(jié)合，能夠明顯抑制TNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)，其抑制活性比單獨(dú)的PT4有明顯提高。 (2)考察能否利用人抗體可變區(qū)的框架結(jié)構(gòu)作為支架，同時展示三個活性肽段。選擇已設(shè)計的功能肽PT2

4、、PT3和PT4，分別替換人抗體IgG重鏈可變區(qū)的三個CDR區(qū)，設(shè)計成抑制TNF-α的新型分子(命名為PTVH)。利用同源模建技術(shù)從1七類VH中選擇VH5作為支架，同時展示PT2、PT3和PT4，設(shè)計成新型分子PTVH5。純化的PTVH5能夠識別TNF-α的141-146表位，競爭抑制Z12-HRP與TNF-α結(jié)合，能夠抑制TNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞毒，抑制能力比展示的單獨(dú)短肽PT2、PT3或PT4有明顯提高。 (3)以抗體H22(以

5、Z12為模板，結(jié)合鏈替換技術(shù)篩選噬菌體庫得到的親和力比Z12明顯提高的一株抗體)為模板，進(jìn)一步優(yōu)化抗原與抗體相互識別的作用模式，建立相應(yīng)的數(shù)學(xué)模型，根據(jù)這個模型設(shè)計了新的TNF-α拮抗肽。所設(shè)計的拮抗肽能夠抑制Z12與TNF-α結(jié)合，能夠抑制TNF-α介導(dǎo)的caspase活性以及TNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性，其活性比模型優(yōu)化前所設(shè)計的短肽有明顯提高。 本論文初步建立了根據(jù)抗原—抗體復(fù)合物空間結(jié)構(gòu)信息、支架(FC、抗體可變區(qū)基因骨架