蜱體伯氏疏螺旋體分離鑒定及萊姆病ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、萊姆病是經(jīng)硬蜱傳播的，由伯氏疏螺旋體引起的人畜共患病。該病呈世界性分布，目前，全球估計(jì)年發(fā)病人數(shù)約為30萬人左右，且有不斷增長(zhǎng)的趨勢(shì)。在美國(guó)，萊姆病有“第二艾滋病”之稱，1992年世界衛(wèi)生組織將此病列為重點(diǎn)防治對(duì)象，現(xiàn)已成為全球性的公共衛(wèi)生問題之一。近年來，對(duì)萊姆病病原生物學(xué)、致病機(jī)理、流行病學(xué)、診斷及綜合防治方面的研究已取得了一定的成果，但由于伯氏疏螺旋體抗原結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性以及萊姆病的臨床癥狀的多樣性，使得該病的確診較困難。另外，萊姆病

2、作為一種新發(fā)病，在我國(guó)對(duì)其傳播媒介蜱的種類尚未完全明晰，同時(shí)關(guān)于其病原體的基因型及分類地位均未闡明，這給診斷和防治該病帶來極大的挑戰(zhàn)。因此，闡明其傳播媒介的種類和病原體的分類地位將有助于我們建立高效、快速診斷手段，合理地開展該病的防治工作。
　　 本文主要在萊姆病病原體的分類學(xué)及其診斷學(xué)兩個(gè)方面進(jìn)行探索。(1)對(duì)源于我國(guó)部分林區(qū)采集的亞洲璃眼蜱(Hyalomma asiaticum)、長(zhǎng)角血蜱(Haemaphysalis lon

3、gicornis)等多種蜱種進(jìn)行伯氏疏螺旋體的檢測(cè)；(2)對(duì)所分離的螺旋體進(jìn)行分型研究；(3)對(duì)所獲得的伯氏疏螺旋體鞭毛基因及鞭毛基因的保守區(qū)段進(jìn)行克隆，并在體外表出達(dá)伯氏疏螺旋體鞭毛基因保守區(qū)段，用保守區(qū)段重組蛋白作為萊姆病的診斷抗原，建立萊姆病ELISA診斷方法。
　　 第一部分，用套式PCR方法擴(kuò)增蜱體內(nèi)的伯氏疏螺旋體鞭毛基因，對(duì)采自新疆、青島和延邊等地區(qū)的亞洲璃眼蜱和長(zhǎng)角血蜱及蜱腸培養(yǎng)物進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)PCR所擴(kuò)增目的基因片

4、段進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)GenBank中的blast比對(duì)分析。采用BSK-H固體培養(yǎng)基分離培養(yǎng)技術(shù)，從蜱腸內(nèi)分離和純化伯氏疏螺旋體單克隆，并采用分子生物學(xué)方法對(duì)分離到的單克隆菌落進(jìn)行分型。首先對(duì)新疆地區(qū)的亞洲璃眼蜱和鐮形扇頭蜱在顯微鏡下進(jìn)行解剖，取其腸，用BSK-H液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，收集蜱腸培養(yǎng)物，提取其基因組DNA，采用套式PCR方法擴(kuò)增鞭毛基因。然后，對(duì)經(jīng)鑒定含有伯氏螺旋體的腸培養(yǎng)物，利用BSK-H固體培養(yǎng)分離技術(shù)，對(duì)其進(jìn)行分離純化

5、，建立了一種快速而方便的分離伯氏疏螺旋體培養(yǎng)方法。最后，應(yīng)用recA基因和5S-23S間區(qū)基因作為分型的靶基因?qū)Ψ蛛x到的伯氏疏螺旋體單克隆進(jìn)行初步分型，recA基因是與伯氏疏螺旋體進(jìn)化相關(guān)的基因，其GC含量的變化可以通過熒光定量PCR的熔解曲線很容易的反映出來，根據(jù)此特性，用定量熒光PCR熔解曲線對(duì)分離到的螺旋體單克隆進(jìn)行初步分型。經(jīng)初步分型，本次從亞洲璃眼蜱中分離到伽氏疏螺旋體、狹義的伯氏疏螺旋體等菌株。同時(shí)為進(jìn)一步確定螺旋體基因型，

6、對(duì)其5S-23S間區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)其測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步分型。伯氏疏螺旋體單克隆的分離及初步分型的研究，為萊姆病病原生物學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分，對(duì)萊姆病血清學(xué)診斷技術(shù)進(jìn)行了研究。該研究用重組伯氏疏螺旋體鞭毛基因蛋白作為診斷抗原，建立萊姆病ELISA診斷方法。本研究利用生物工程方法，選取鞭毛基因的氨基酸序列的第131-266區(qū)段作為目的片段，對(duì)其克隆，連接到PGEX-4T-1表達(dá)載體上，構(gòu)建保守基

7、因片段的重組質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞BL21中，原核表達(dá)伯氏疏螺旋體鞭毛基因抗原性和保守性較強(qiáng)的區(qū)段的平截性蛋白，用GST.BIND純化系統(tǒng)純化伯氏疏螺旋體鞭毛基因重組蛋白，所純化的蛋白用作診斷抗原；同時(shí)將伯氏疏螺旋體分別接種小鼠和兔，兩周后收集血清，用上述診斷抗原鑒定，發(fā)現(xiàn)經(jīng)感染的小鼠和兔血清均為陽性血清，建立了敏感性和特異性較高的ELISA診斷方法。此方法為解決萊姆病診斷困難、難以確診提供了一種有益的借鑒，特別為萊姆病早期的診斷提