殼多糖和外源性堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子聯(lián)合應(yīng)用對(duì)創(chuàng)傷愈合影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：聯(lián)合應(yīng)用殼多糖(chitosan，CTS)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growt factor，bFGF)干預(yù)大鼠背部創(chuàng)傷模型，觀察其對(duì)鼠背部創(chuàng)面愈合的影響，并探討作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 方法 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：48只雄性健康Wistar大鼠，體重200g-250g，編號(hào)。 2 動(dòng)物分組：將大鼠隨機(jī)分為四組，即對(duì)照組、CTS組、bFGF組、CTS+bFGF組，每組均

2、為12只。 3 創(chuàng)傷模型制備方法：腹腔注射10％水合氯醛(30mg/kg)麻醉，8％硫化鈉背部脫毛備皮，面積為4×5cm<'2>。次日，麻醉成功后，將大鼠固定于手術(shù)臺(tái)上。在背部脊柱兩側(cè)旁開(kāi)0.9cm，頭尾兩端平行于脊柱各標(biāo)記一直徑1.8cm，面積2.54cm<'2>的圓形切口線(xiàn)。經(jīng)消毒鋪巾后，用手術(shù)刀沿標(biāo)記線(xiàn)切除全層皮膚至深筋膜，形成4個(gè)圓形創(chuàng)面。 4 給藥方法：對(duì)照組、CTS組、bFGF組、CTS+bFGF組分別用蒸餾

3、水、CTS、bFGF、CTS+bFGF藥液浸透雙層紗布覆蓋創(chuàng)面，再蓋以凡士林油砂，無(wú)菌紗布包扎，繃帶固定，每日換藥一次。 5 取材：每組動(dòng)物分為4組，每組3只，分別于術(shù)后第3、7、10、14天切取原創(chuàng)傷范圍內(nèi)組織。所取組織中用4％多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，分別行常規(guī)HE染色、Massoll染色和免疫組化染色。 6 觀測(cè)指標(biāo) 6．1創(chuàng)面大體觀察：每日換藥時(shí)肉眼觀察創(chuàng)面炎癥反應(yīng)。 6．2創(chuàng)面愈合時(shí)間

4、：以創(chuàng)面面積小于總面積的5％或愈合面積大于95％為完全愈合。 6．3創(chuàng)面愈合率的觀察：各組動(dòng)物分別在傷后第3、7、10、14天，用0.25×0.25的透明方格紙測(cè)定傷口面積，用德國(guó)產(chǎn)ASM-68K半自動(dòng)圖像分析儀計(jì)算傷口面積。傷口愈合速率=愈合面積/原傷口面積×100％。 6．4光鏡組織學(xué)觀察：HE染色和Masson染色后，觀察術(shù)后第3、7、10、14天組織中新生毛細(xì)血管，膠原纖維以及細(xì)胞滲出的變化。 6．5膠原

5、纖維面密度(area density on area，AA)：Masson染色組織切片，在肉芽組織中央淺部、中央深部、兩側(cè)部各隨機(jī)選取5個(gè)視野，利用計(jì)算機(jī)輔助病理圖像分析系統(tǒng)計(jì)算綠染的膠原纖維的面密度，結(jié)果取均數(shù)。 6．6血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vasctllar Endothelial GrowthFactor,VEGF)免疫組化染色切片：光鏡觀察血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子分布部位和表達(dá)。采用Motic Med6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行

6、定量分析，每組選4張切片，每張切片選取有代表性區(qū)域，隨機(jī)取互不重疊的5個(gè)200倍視野，以光密度200為背底，彩色攝像機(jī)取圖，測(cè)量平均光密度和積分光密度值并用計(jì)算機(jī)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 6．7-氧化氮合酶(nitric oxide syntlaase，NOS)免疫組化染色切片，光鏡觀察NOS分布部位和著色深淺程度。在200倍光鏡下隨機(jī)選5個(gè)視野，計(jì)算總細(xì)胞數(shù)和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率。 7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：用SPSS13.

7、0統(tǒng)計(jì)處理軟件，對(duì)各種數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。 結(jié)果 1 創(chuàng)面大體觀察：傷后早期對(duì)照組創(chuàng)面腫脹、滲出及創(chuàng)周紅腫最為明顯，CTS組、bFGF組依次次之，CTS+bFGF組最輕，各組均未感染。 2 創(chuàng)面愈合時(shí)間的觀察：對(duì)照組為15.28±0.6419天、CTS組為14.02±0.4817天、bFGF組為12.50±0.6245、CTS+bFGF組為10.24±0.4827天，四組有非常顯著性差異(單向方差分析，F(xiàn)=74.23

8、，P(0.01)。CTS+bFGF組愈合天數(shù)明顯短于CTS組、bFGF組和對(duì)照組(P<0.01)。 3 創(chuàng)面愈合率的觀察：從附表2可見(jiàn)，CTS+bFGF組創(chuàng)面愈合率高于bFGF組、CTS組以及對(duì)照組，四組有顯著性差異(重復(fù)測(cè)量方差分析，F(xiàn)=410.36，P<0.05)，兩兩比較有非常顯著性差異(P<0.01)；愈合率隨時(shí)間推移明顯升高(F=637.86，P<0.01)，四個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩兩比較有非常顯著性差異(P<0.01)。組別與時(shí)

9、間交互效應(yīng)有顯著性差異(F=44.54，P<0.05)。 4 光鏡觀察：CTS+bFGF組、CTS組以及bFGF組在創(chuàng)傷后第3天比對(duì)照組有較多毛細(xì)血管生成，創(chuàng)傷后14天成纖維細(xì)胞排列整齊。 5 膠原纖維面密度(AA)：四組均成持續(xù)性增加趨勢(shì)，傷后四組有非常顯著性差異(F=937.46，P<0.01)，CTS+bFGF組明顯高于其它三組(P<0.01)，但對(duì)照組第與CTS組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；傷后3、7、10

10、、14天之間，兩兩比較均有非常顯著性差異(P(0.01)；組別與時(shí)間之間交互效應(yīng)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.49，P>0.05)。 6 VEGF免疫組化染色結(jié)果：四組大血管和新生毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞均有陽(yáng)性表達(dá)。對(duì)照組第3天和第14天分別呈現(xiàn)VEGF陽(yáng)性顆粒表達(dá)高峰。而CTS組VEGF表達(dá)則在第7天達(dá)到高峰，之后緩慢下降。CTS+bFGF組和bFGF組在傷后第10天達(dá)到最高，至傷后第14天仍保持較高水平。傷后四組兩兩比較有非常顯著性差

11、異(F=1217.35，P<0.01)，CTS+bFGF組明顯高于其它三組(P<0.01)；傷后3、7、10、14天之間，兩兩比較均有顯著性差異(P<0.05)；組別與時(shí)間之間交互效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=48.12，P<0.05)。 7 NOS在創(chuàng)面組織中的表達(dá)：皮膚中角質(zhì)形成細(xì)胞、汗腺和骨骼肌細(xì)胞以及創(chuàng)傷后肉芽組織的炎癥細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞均可表達(dá)NOS蛋白。傷后四組兩兩比較有非常顯著性差異(F=234.45，P<0