EGFR信號(hào)誘導(dǎo)PKM2-β-catenin核轉(zhuǎn)位促進(jìn)原發(fā)性肝癌根治性切除術(shù)后早期復(fù)發(fā).pdf

1、根治性切除是早期肝癌治療最理想的手段，然而仍然有30-50％的患者預(yù)后較差，在諸多影響預(yù)后的因素中，早期復(fù)發(fā)又是其中最重要的因素之一。肝癌的早期復(fù)發(fā)是指根治性切除術(shù)后一年內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的肝內(nèi)或肝外轉(zhuǎn)移灶，而且這種轉(zhuǎn)移灶的惡性程度較高，因此，預(yù)防早期復(fù)發(fā)是改善肝癌根治性切除術(shù)患者預(yù)后最關(guān)鍵的途徑。然而，一方面，臨床上尚無(wú)準(zhǔn)確預(yù)測(cè)肝癌根治性切除后早期復(fù)發(fā)的指標(biāo)，另一方面，肝癌根治性切除術(shù)后早期復(fù)發(fā)(Early Recurrence of H

2、CC after Radical Resection,ERHRR)的分子機(jī)制不明，因此，尋找準(zhǔn)確預(yù)測(cè)早期復(fù)發(fā)的指標(biāo)和揭示早期復(fù)發(fā)的分子機(jī)制迫在眉睫。
　　肝癌根治性切除后早期復(fù)發(fā)主要是癌細(xì)胞肝內(nèi)或肝外轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的結(jié)果，本課題組對(duì)肝癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制進(jìn)行了大量的研究，發(fā)現(xiàn)相關(guān)生長(zhǎng)因子控制的下游信號(hào)通路活化是肝癌惡變的一個(gè)重要標(biāo)志。新近的臨床研究表明EGFR信號(hào)在40-70％肝癌患者處于激活狀態(tài)，然而其與ERHRR的關(guān)系尚不清楚?？紤]到EGF

3、R信號(hào)在肝癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用，我們提出EGFR信號(hào)的激活可能是參與ERHRR的分子機(jī)制之一的科學(xué)假說(shuō)。
　　本論文首先探討了EGFR信號(hào)與ERHRR的相關(guān)性。以免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)62例原發(fā)性肝癌根治性切除患者新鮮肝癌組織標(biāo)本中p-EGFR水平，并用Kaplan-Meier分析p-EGFR的表達(dá)與早期復(fù)發(fā)的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，58％的肝癌患者p-EGFR呈陽(yáng)性表達(dá)，統(tǒng)計(jì)分析顯示肝癌組織標(biāo)本中p-EGFR的水平與根治性切除術(shù)后早期

4、復(fù)發(fā)具有明顯的相關(guān)性。體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，五種人肝癌細(xì)胞株中，HepG2和SMMC-7721中EGFR的表達(dá)最高，同樣，二者對(duì)EGF刺激的反應(yīng)也最敏感，EGF(100ng/ml)處理12h后，細(xì)胞即出現(xiàn)了明顯的間質(zhì)化形態(tài)，同時(shí)細(xì)胞遷移能力明顯增加，提示活化EGFR信號(hào)誘導(dǎo)了肝癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)化。目前已明確，EMT是肝癌發(fā)生肝內(nèi)轉(zhuǎn)移必須經(jīng)歷的過(guò)程。因此，我們推測(cè)EGFR信號(hào)誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞EMT可能是導(dǎo)致ERHRR的重要機(jī)制之一。本論文接下來(lái)

5、主要研究:①EGFR信號(hào)誘發(fā)ERHRR的分子機(jī)制;②嘗試尋找預(yù)測(cè)EGFR信號(hào)上調(diào)的ERHRR的可靠指標(biāo)。
　　體外機(jī)制研究，現(xiàn)已明確，多種生長(zhǎng)因子(TGF-β，HGF)均可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞EMT過(guò)程，有趣的是，β-catenin均在其中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。本論文研究發(fā)現(xiàn)，EGF誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞EMT過(guò)程和運(yùn)動(dòng)遷移同樣需要β-catenin的參與，進(jìn)一步機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)，β-catenin參與EGF誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞EMT和遷移是通過(guò)上調(diào)β-cat

6、enin-TCF/LEF轉(zhuǎn)錄活性，上調(diào)其靶基因Snail來(lái)實(shí)現(xiàn)的。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)EGF誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞β-catenin-TCF/LEF轉(zhuǎn)錄活化不是Wnt信號(hào)通路依賴的，而是PI3K/AKT和ERK信號(hào)通路依賴的，深入的研究發(fā)現(xiàn)，在EGF誘導(dǎo)的β-catenin-TCF/LEF轉(zhuǎn)錄激活的過(guò)程中，PI3K/AKT調(diào)控β-catenin入核，而ERK調(diào)控PKM2入核，兩者共同調(diào)控TCF/LEF的轉(zhuǎn)錄活性。
　　為了進(jìn)一步驗(yàn)證體外機(jī)制研究

7、的結(jié)果，本論文對(duì)62例肝癌患者新鮮標(biāo)本包括E-cadherin，Snail，β-catenin，PKM2相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，并采用了相關(guān)的統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行了分析。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，p-EGFR的表達(dá)與Snail，核內(nèi)PKM2，核內(nèi)β-catenin的表達(dá)呈正相關(guān)，而與E-cadherin成負(fù)相關(guān)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)snail的表達(dá)水平與核內(nèi)PKM2和β-catenin共同表達(dá)水平呈正相關(guān)，而E-cadherin的表達(dá)水平與核內(nèi)PKM2和β-ca

8、tenin共同表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。另外，本論文還對(duì)E-cadherin，Snail及核內(nèi)PKM2/β-catenin共表達(dá)水平與早期復(fù)發(fā)率進(jìn)行了Kaplan-Meier分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)E-cadherin和Snai的表達(dá)水平與早期復(fù)發(fā)無(wú)明顯的相關(guān)性，而核內(nèi)PKM2/β-catenin共表達(dá)水平與早期復(fù)發(fā)呈現(xiàn)良好的相關(guān)性，p-EGFR陽(yáng)性表達(dá)和核內(nèi)PKM2/β-catenin陽(yáng)性的患者具有最高的復(fù)發(fā)率68.64％。COX多因素分析也證實(shí)PKM

9、2/β-catenin核內(nèi)共表達(dá)是影響ERHRR獨(dú)立的因素。
　　PKM2/β-catenin共表達(dá)水平與早期復(fù)發(fā)呈現(xiàn)良好的相關(guān)性，而其下游指標(biāo)Snail和E-cadherin的表達(dá)水平與早期復(fù)發(fā)卻無(wú)明顯的相關(guān)性。緊接著本論文又對(duì)這一似乎矛盾的結(jié)論進(jìn)行了深入的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EGFR信號(hào)不僅誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞侵襲，還對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖產(chǎn)生影響。有趣的是，EGFR信號(hào)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響與EGFR活化的時(shí)間相關(guān)，短時(shí)間(24h以內(nèi))活化EG

10、FR信號(hào)抑制SMMC-7721和HepG2的增殖，機(jī)制與細(xì)胞周期阻止相關(guān);長(zhǎng)時(shí)間(72h)活化EGFR信號(hào)明顯促進(jìn)SMMC-7721和HepG2的增殖，其機(jī)制與上調(diào)C-myc和CyclinD1表達(dá)有關(guān)。體內(nèi)EGFR信號(hào)是處于持續(xù)性活化狀態(tài)，臨床標(biāo)本分析也證實(shí)，Ki-67的表達(dá)不僅與p-EGFR的表達(dá)呈正相關(guān)，還與PKM2/β-catenin核共表達(dá)呈正相關(guān)。復(fù)發(fā)分析發(fā)現(xiàn)E-cadherin(-)/Ki-67(+)的肝癌根治性切除患者具有

11、很高的復(fù)發(fā)率。綜上，EGFR信號(hào)持續(xù)的激活促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲和增殖導(dǎo)致肝癌根治性切除患者的早期復(fù)發(fā)。
　　本論文通過(guò)體內(nèi)和體外的研究確證了EGFR信號(hào)在根治性切除肝癌患者術(shù)后早期復(fù)發(fā)中的作用，并闡明了其分子機(jī)制，為EGFR信號(hào)活化的肝癌根治性切除患者的早期復(fù)發(fā)提供了可靠的預(yù)測(cè)指標(biāo)和防治的治療策略。更重要的是，本論文是課題組“國(guó)家自然自然基金”和“博士點(diǎn)基金”項(xiàng)目中的部分研究?jī)?nèi)容，為含丹參類中藥復(fù)方預(yù)防ERHRR的研究提供了醫(yī)學(xué)分子生