山楂抗菌增敏活性物質(zhì)的定向分離及生物學活性研究.pdf

1、目的:
　　耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant staphylococcus aureus,MRSA)是臨床常見的病原菌,治療棘手,死亡率高,已成為嚴重的臨床醫(yī)學及公共衛(wèi)生問題。自1961年首次發(fā)現(xiàn)MRSA以來,MRSA成為醫(yī)院感染重要的革蘭陽性細菌,多重耐藥現(xiàn)象日益嚴重,呈現(xiàn)出對除糖肽類抗生素之外的其他抗菌藥物,特別是β-內(nèi)酰胺類抗生素的高水平耐藥。萬古霉素是治療MRSA感染的“最后防線”,但近

2、年來,國外部分地區(qū)已相繼檢出對萬古霉素耐藥(Vancomycin-resistant staphylococcus aureus,VRSA)或中介的金黃色葡萄球菌(Vancomycin-intermediary staphylococcus aureus,VISA)。因此,基于MRSA的耐藥機制研究有效的治療措施具有重要意義。
　　MRSA對抗生素的主要耐藥機制為:①表達特殊的青霉素結(jié)合蛋白------PBP2a,PBP2a可以代

3、償被抗生素抑制了的青霉素結(jié)合蛋白的轉(zhuǎn)肽酶活性,從而維持細菌細胞壁的合成;②產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶,β-內(nèi)酰胺酶利用其活性位點的絲氨酸水解β-內(nèi)酰胺環(huán),水解β-內(nèi)酰胺類抗生素而致耐藥;③增強的細菌主動外排系統(tǒng),以減少抗生素在菌體內(nèi)積聚。
　　目前,針對MRSA的耐藥機制而研發(fā)抗MRSA感染的藥物主要有兩種策略:一是直接抗菌策略。包括全新結(jié)構(gòu)化合物的發(fā)現(xiàn)和對現(xiàn)有抗生素結(jié)構(gòu)的修飾,但全新結(jié)構(gòu)化合物的發(fā)現(xiàn)需要較長周期,而對現(xiàn)有抗生素結(jié)構(gòu)的修飾如

4、替考拉寧并未體現(xiàn)出較萬古霉素更好的療效。二是間接抗菌策略。即研究具有增強現(xiàn)有抗生素作用的藥物,稱之為抗菌增敏劑。這類藥物它們本身并不具有抗菌活性,但可恢復細菌對現(xiàn)有抗生素的敏感性、減少現(xiàn)有抗生素的使用量,并減少耐藥菌株的產(chǎn)生。因此,新型抗菌增敏劑的研究是目前研究的焦點與熱點。
　　來自天然植物的化合物是新型抗菌增敏劑的源泉。中藥長期用于感染性疾病的治療,為尋找新型抗菌增敏劑提供了豐富的資源。
　　本課題組前期已建立定向分離化

5、學物質(zhì)的技術(shù)平臺,即利用生物傳感器技術(shù)將PBP2a蛋白成功包被于生物傳感器樣品池上,用于篩選與PBP2a具有高親和力的中藥。本研究以標準菌株MRSA為研究對象,首先以PBP2a為靶點從78種傳統(tǒng)中藥中篩選出與PBP2a具有高親和力的中藥;其次以體外抗菌增敏活性為導向,從與PBP2a具有高親和力的中藥中篩選出具有最佳抗菌增敏活性的中藥—山楂;然后以山楂為研究對象,進行具有抗菌增敏活性物質(zhì)的定向分離、體內(nèi)外生物學活性研究及其抗菌增敏作用機制

6、初步研究。
　　方法:
　　1.將天然藥化分離手段與生物學活性評價相結(jié)合,從山楂中定向分離具有抗菌增敏活性的組分和單體化合物
　　2.活性化合物或組分的體外藥效學研究
　　2.1.正交實驗篩選具有最佳抗菌增敏活性的化合物配伍和配伍比,命名最佳配伍比的化合物為CE
　　2.2.微孔二倍稀釋法測定活性化合物與抗生素的FICI
　　3.CE的體內(nèi)生物學活性研究
　　建立亞致死劑量WHO-2攻擊小鼠膿毒

7、癥模型,觀察CE聯(lián)合苯唑西林對亞致死劑量WHO-2攻擊小鼠膿毒癥模型外周血中細菌數(shù)量和前炎癥細胞因子、C-反應(yīng)蛋白、前降鈣素水平的影響
　　4.CE抗菌增敏作用機制的初步研究
　　4.1.利用生物傳感器技術(shù)觀察CE與PBP2a的親和力;RT-PCR方法觀察CE對mecA基因表達的影響
　　4.2.nitrocefin法觀察CE對WHO-2菌β-內(nèi)酰胺酶的影響
　　4.3.激光共聚焦、熒光分光光度法觀察CE對柔紅霉

8、素在WHO-2內(nèi)聚集的影響;RT-PCR法觀察CE對WHO-2細菌外排泵基因表達的影響
　　4.4.透射電鏡技術(shù)觀察CE對WHO-2菌細胞壁形態(tài)的影響
　　4.5.利用Trixton-X誘導WHO-2自溶后,觀察CE對細菌自溶速率的影響;RT-PCR技術(shù)觀察CE對WHO-2菌自溶相關(guān)基因表達的影響
　　結(jié)果:
　　1.以PBP2a和抗菌增敏活性為導向,從78種中藥中篩選得到具有穩(wěn)定的抗菌增敏活性的山楂水提物

9、>　　2.從山楂中定向分離得到具有最佳抗菌增敏活性的化合物組分CP;從CP中分離得到3個單體化合物,經(jīng)結(jié)構(gòu)解析后確認為(+)-兒茶素(簡稱為C)、(-)-表兒茶素沒食子酸酯(簡稱為ECg)和(-)-表沒食子兒茶素(簡稱為EGC)
　　3.活性化合物或組分的體外、體內(nèi)藥效學研究
　　3.1.具有最佳抗菌增敏活性的化合物配伍質(zhì)量比為8:1,即C128μg/mL、ECg16μg/mL,將8:1配伍的C和ECg命名為CE
　　

10、3.2.CE可增加45株MRSA臨床分離株對6種β-內(nèi)酰胺類抗生素(苯唑西林,氨芐西林,舒氨西林,頭孢唑林,頭孢吡肟和亞胺培南/西司他丁)的敏感性
　　3.3.CE可降低亞致死劑量WHO-2攻擊小鼠膿毒癥模型的外周血中細菌數(shù)量和前炎癥因子TNF-α、CRP、PCT的水平
　　4.CE抗菌增敏作用機制的初步研究
　　4.1.C、ECg與PBP2a蛋白的親和力均較低,且不影響mecA基因的表達
　　4.2.CE不影響