生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)天然手性γ-癸內(nèi)酯.pdf

1、γ-癸內(nèi)酯具有桃子的香氣，存在于多種食品中，是香精香料行業(yè)廣泛應(yīng)用的一種香原料。過去，γ-癸內(nèi)酯主要是從水果中提取或是化學(xué)合成的，隨著消費(fèi)者對(duì)天然產(chǎn)品需求的上升，研究人員開始使用生物技術(shù)制取γ-癸內(nèi)酯的方法。 微生物法是生產(chǎn)較安全的、高生物活性的香味化合物及其復(fù)合物最有前途的方法。有許多專利和文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于微生物法合成γ-癸內(nèi)酯的工藝，使用如Sporidiobolusruinenii、Sporidiobolussalmonicol

2、or、Yarrowialipolytica、Sporobolomycesodorus等菌種，均能利用蓖麻油、蓖麻油酸或蓖麻油酸甲酯生產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯。由于微生物法生產(chǎn)的γ-癸內(nèi)酯大多具有旋光活性，在香料行業(yè)有特殊的用途，本研究選擇了采用微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯的路徑。 本研究的工作包括： 1.對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道的產(chǎn)內(nèi)酯菌株進(jìn)行了篩選，得到一株較為適宜的菌株YarrowialipolyticaAs2.1405作為出發(fā)菌株，并確定了初

3、篩培養(yǎng)基配方和條件，初始搖瓶平均產(chǎn)量為0.6g/L。 2.YarrowialipolyticaAs2.1405連續(xù)經(jīng)過紫外誘變、NTG誘變、DES誘變和鈷60誘變，最終篩選得到一株高產(chǎn)內(nèi)酯菌種167＃，搖瓶平均產(chǎn)量為1.4g/L，遺傳穩(wěn)定性良好。 3.對(duì)培養(yǎng)基配方中的碳、氮源以及一些維生素和無機(jī)鹽離子濃度進(jìn)行了優(yōu)化試驗(yàn)。經(jīng)過培養(yǎng)基配方優(yōu)化，確定了最優(yōu)組合配方。其工藝條件經(jīng)優(yōu)選為：裝液量50mL/500mL，pH6.5，培

4、養(yǎng)溫度28℃，搖床轉(zhuǎn)速200rpm，發(fā)酵48小時(shí)，癸內(nèi)酯平均產(chǎn)量2.04g/L。 4.研究了γ-癸內(nèi)酯及其相應(yīng)羥基酸—4-羥基癸酸(4-HydroxydecanoicAcid，HA)對(duì)Yarrowialypolytica菌株生長(zhǎng)的影響，80mg/L的癸內(nèi)酯就已對(duì)菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生了強(qiáng)烈的抑制作用，癸內(nèi)酯濃度達(dá)到200mg/L以上時(shí)，菌體完全不生長(zhǎng)，說明癸內(nèi)酯對(duì)YarrowiaLypolytica菌體細(xì)胞有較強(qiáng)的毒性。羥基酸濃度低于20

5、0mg/L時(shí)基本不影響菌體的生長(zhǎng)，羥基酸濃度達(dá)到400mg/L時(shí)才開始對(duì)菌體生長(zhǎng)出現(xiàn)抑制。比較γ-癸內(nèi)酯和4-羥基癸酸對(duì)菌體最太生長(zhǎng)速率的影響可以看出4-羥基癸酸對(duì)Yarrowialypoiytica菌株的生長(zhǎng)也有—定的影響，但毒性相對(duì)于γ-癸內(nèi)酯要小得多。因此在發(fā)酵生產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯的過程中，應(yīng)盡量控制產(chǎn)物以羥基酸的形式存在，以減小產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的抑制。 5.經(jīng)過搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化后，利用5L和50L自控發(fā)酵罐進(jìn)行放大試驗(yàn)。試驗(yàn)表明溶

6、氧、轉(zhuǎn)速以及蓖麻油的添加方式對(duì)于發(fā)酵產(chǎn)率有較大的影響。在適宜的溶氧和轉(zhuǎn)速的條件下，在發(fā)酵初期種子生長(zhǎng)階段不添加蓖麻油或添加少量蓖麻油進(jìn)行誘導(dǎo)，種子生長(zhǎng)旺盛后再加入大量蓖麻油進(jìn)行轉(zhuǎn)化，癸內(nèi)酯產(chǎn)量達(dá)到3.2g/L以上，有效提高了蓖麻油的轉(zhuǎn)化率，癸內(nèi)酯產(chǎn)量比原始出發(fā)菌種提高了5倍。 6.對(duì)發(fā)酵液后處理進(jìn)行了摸索，確定了后處理工藝：發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液經(jīng)酸化、加熱、離心、有機(jī)溶劑萃取、溶劑回收、粗餾、精餾等一系列操作最終得到γ-癸內(nèi)酯產(chǎn)品，

7、并確定了各操作單元的工藝參數(shù)。最終產(chǎn)品純度：98.3％，旋光度[()]20D：+38.12度(理論值為+48.5度)，對(duì)映體過量率(e.e.％)：93.42％，產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)達(dá)到國(guó)際水平。 由于粗餾和精餾過程溫度較高，時(shí)間較長(zhǎng)，終產(chǎn)品中易混有焦糊昧，因此探索了利用超臨界二氧化碳萃取來替代高溫減壓蒸餾過程。試驗(yàn)結(jié)果表明超臨界二氧化碳萃取和分餾過程聯(lián)用，對(duì)癸內(nèi)酯進(jìn)行粗提，可以取得較好效果。 7.在50L自控罐的試驗(yàn)數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上進(jìn)