基于脂肪酶界面活化特性的固定化技術.pdf

1、脂肪酶是一種非常重要的水解酶，大部分脂肪酶的活性部位上有一個“蓋子”的α-螺旋結構，這種結構賦予它在油/水界面上表現(xiàn)出特殊的催化活性，“界面活性”。脂肪酶的這一特性與其“蓋子”的打開或閉合構象密切相關。基于脂肪酶“界面活化”的性能，調(diào)控載體材料的表面化學組成已成為研究脂肪酶固定化技術的重要手段。本文首先利用多種端基功能化聚苯乙烯載體，從載體表面親疏水性能研究脂肪酶的催化性能。其次，將生物表面活性劑膽汁鹽與脂肪酶（真菌類CRL，Candi

2、da rugosa和哺乳類PPL，Porcine pancreatic）共混，從催化活性、表面張力及氣/液界面C-H振動信號來研究膽汁鹽濃度對脂肪酶界面吸附性能的影響?；谀懼}對脂肪酶的活化作用，分別研究了膽汁鹽濃度對兩類自由脂肪酶手性拆分能力的影響和膽汁鹽改性載體材料對固定化脂肪酶手性拆分能力的影響。最后，選擇LB膜固定化方法，考察膽汁鹽和載體對脂肪酶催化性能的影響，同時還設計控制辣根過氧化物酶（HRP）活性位取向的LB膜法進行研究

3、。初步實現(xiàn)了從調(diào)控脂肪酶界面活化性能角度來設計脂肪酶固定化技術，具體的結論如下:
　　1.制備了帶不同功能基團聚苯乙烯載體材料，載體表面接觸角為-COOH(68.4°)＜-OH(76.3°)＜NH2(80.1°)＜PS(87.7°)＜-CH3(98.9°)＜-CF3(99.6°)。脂肪酶吸附后的活性為-OH(92.78％)＞-NH2(76.22％)＞-COOH(20.03％)＞-CH3(2.64％)＞PS(1.91％)＞-CF3(

4、1.23％)。影響其催化性能的因素主要由載體對脂肪酶吸附量差異、脂肪酶底物及產(chǎn)物親和性差異及酶構象的改變共同決定。脂肪酶在載體表面吸附量:-CF3(42.45 mg/m2)＞-CH3(28.67 mg/m2)＞PS(20.32mg/m2)＞-COOH(11.86 mg/m2)＞-NH2(3.96 mg/m2)＞-OH(3.11 mg/m2)。疏水載體對脂肪酶吸附能力明顯高于親水載體。此外，由SFG數(shù)據(jù)證實了在疏水端基改性PS表面，酶分子

5、構象改變較大;而親水端基改性表面酶構象保持較好。
　　2.膽汁鹽的濃度效應對兩類脂肪酶的影響表現(xiàn)一致。在低脫氧膽酸鈉(NaDC)濃度下， NaDC與脂肪酶相互競爭吸附，且部分脂肪酶被NaDC取代，SFG顯示仍有部分脂肪酶氨基酸殘基CH2伸縮振動信號。而在高濃度下，NaDC逐漸取代脂肪酶，SFG譜圖只檢測到純NaDC甲基伸縮(2870 cm-1)及費米共振(2945 cm-1)。在低NaDC(＜2mM)濃度下，膽汁鹽活化脂肪酶，由于

6、膽汁鹽誘導脂肪酶活性位上“蓋子”打開，暴露疏水殘基，表面張力達到最低值分別為CRL41.26 mN/m，PPL40.22mN/m。在高濃度下，過量NaDC分子完全占據(jù)脂質界面，抑制脂肪酶吸附，從而導致酶活性下降。
　　3.苯乙醇手性拆分體系中，膽汁鹽(NaDC和NaC)低濃度下可提高脂肪酶水解活性， NaDC濃度在2mM-4mM間水解活性最大，NaC濃度在8mM左右最大，高濃度下有一定抑制作用。低濃度膽汁鹽對對映體過量值eep也有

7、一定提高，尤其是PPL，不加膽汁鹽對映體過量值eep約為60％，當NaDC濃度為4mM時，eep值可達93％; NaC濃度為2mM時，eep值最高達73％。
　　4.制備不同親疏水改性聚丙烯腈表面，表面接觸角為(37.9°)＞PAN-NH2(58.0°)＞ PAN-CA(79.8°)＞PAN-DCA(82.5°)＞PAN(88.7°)。脂肪酶在疏水界面親和力更強，對于PPL，吸附量大小順序為PAN(8.29mg/g)＞PAN-NH

8、2(6.17mg/g)＞PAN-DCA(4.83mg/g)＞PAN-CA(4.60mg/g)＞PAN-COOH(2.97mg/g);對于CRL，吸附量順序為:PAN(3.12mg/g)＞ PAN-NH2(2.54mg/g)＞PAN-CA(2.19mg/g)＞PAN-DCA(2.03 mg/g)＞ PAN-COOH(1.94mg/g)。脂肪酶固定在親水改性聚丙烯腈表面，采取蓋子閉合構象，比活性較低，對映體過量值高;固定在疏水改性表面，采取