DNA電化學(xué)傳感器的制備及其在轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品檢測中的應(yīng)用.pdf

1、本論文主要用電化學(xué)方法研究DNA探針在固體電極表面的固定，并以亞甲基藍(MB)為雜交指示劑，將制備的DNA電化學(xué)生物傳感器用于轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品外源基因的檢測。同時研究丁二酮肟雙核銅(Ⅱ)配合物和雙(N-羥乙基氨乙基)草酰胺雙聯(lián)吡啶合銅(Ⅱ)配合物與DNA的相互作用，考察它們作為DNA電化學(xué)雜交指示劑的可能性。 (1)石墨粉、固體石蠟和硬脂酸按一定比例混合制得表面富含羧基的碳糊電極，在電極表面組裝荷正電的鋁離子膜，在硬脂酸鋁離子膜上

2、進行DNA探針的固定以及與目標基因的雜交，并以MB為指示劑檢測固定和雜交的效果。用循環(huán)伏安法優(yōu)化了DNA的固定和雜交條件。該電化學(xué)生物傳感器被成功地用于對轉(zhuǎn)基因大豆的CP4 epsps基因PCR擴增產(chǎn)物的檢測，并對轉(zhuǎn)基因玉米外源BAR基因片段進行定量測定，檢測范周為1.0×10<'-7>mol/L～1.0×10<'-4> mol/L，檢測限為2.25×10<'-8>mol/L。 (2)固體石蠟作粘合劑，制得重現(xiàn)性好、機械強度高的

3、碳糊電極。一定條件下十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)在電極表面自組裝成緊密的單分子層，使電極表面帶有大量的正電荷，進而通過靜電作用將DNA固定在電極表面，以鐵氰化鉀[K<,3>Fe(CN)<,6>]和MB為指示劑對固定條件進行優(yōu)化。結(jié)果表明，在弱堿性條件下，CTAB自組裝膜能較好地固定ssDNA和dsDNA，而且固定的ssDNA雜交性能良好。該傳感器被用于轉(zhuǎn)基因油菜外源NPT Ⅱ(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)基因片段的檢測，并能識別20堿基基因片

4、段中的2堿基錯配。 (3)采用電化學(xué)氧化法使玻碳電極表面生成羧基(-COOH)，以乙基-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)為偶聯(lián)活化劑，分別把乙二胺和乙二醇引入電極表面作為手臂分子，延長的活性中心氨基(-NH<,2>)或羥基(-OH)在EDC存在下可進一步有效地共價固定DNA。用循環(huán)伏安法以MB為指示劑研究固定在電極上的DNA的熱變性及雜交性能。實驗結(jié)果表明：手臂分子的引入，可以改善電極表

5、面的的流體性質(zhì)，有效提高DNA的固定效率以及固定的ssDNA的雜交效率。以乙二醇為手臂分子制備的ssDNA修飾電極(ssDNA/Eg/GCE)被成功地用于植物轉(zhuǎn)基因工程中應(yīng)用的NOS終止子(胭脂堿合成酶基因終止子)基因片段的雜交和識別。乙二胺為手臂分子制備的DNA修飾電極(DNA/En/GCE)重復(fù)性能好，可反復(fù)再生。利用微分脈沖伏安法(DPV)，該DNA電化學(xué)傳感器可有效地對轉(zhuǎn)基因大豆NOS基因PCR擴增樣品進行檢測，并對存在于許多轉(zhuǎn)

6、基因植物中的花椰菜花葉病毒(CaMV 35S)啟動子基因片段進行了定量測定，在5.0x10<'-9>～1.2×10<'-7>mol/L，范圍內(nèi)，CaMV 35S啟動子目標基因的濃度與MB還原峰電流的降低值呈良好的線性關(guān)系。 (4)用循環(huán)伏安法、紫外光譜法、粘度測定等方法研究雙核銅配合物：丁二酮肟雙核銅(Ⅱ)配合物[Cu<,2>(hdmgl)<,4>]和雙(N-羥乙基氨乙基)草酰胺雙聯(lián)吡啶合銅(Ⅱ)配合物[Cu<,2>(bpy)<

7、,2>(HAO)<,2><'2+>]的電化學(xué)特性，以及它們與與DNA的相互作用?？技纏H、溫度、配合物濃度、鹽效應(yīng)等因素對配合物與DNA相互作用的影響，并對配合物與DNA相互作用的機理進行了初步探討。實驗結(jié)果表明，Cu<,2>(hdmg)<,4>可與DNA的堿基結(jié)合形成非電活性物質(zhì)，使溶液中自由Cu<,2>(hdmg)<,4>的濃度降低，氧化峰電流減小。ssDNA充分暴露的堿基使其與Cu<,2>(hdmg)<,4>的結(jié)合能力大于dsDN

8、A。Cu<,2>(hdmg)<,4>與ssDNA和dsDNA的結(jié)合比分別為2∶1和1∶1，結(jié)合常數(shù)分別為3.56x10<'9>和2.75×10<'5>。以Cu<,2>(hdmg)<,4>為電化學(xué)雜交指示劑成功地檢測了轉(zhuǎn)基因玉米外源BAR基因片段。而Cu<,2>(bpy)<,2>(HAO)<,2><'2+>和DNA分子之間存在著較強的靜電作用，ssDNA與配合物的相互作用比dsDNA與配合物的相互作用略強，但差別不大。Cu<,2>(bpy