基于生理特性解析的2-酮基-L-古龍酸發(fā)酵工藝研究.pdf

1、本論文以胞外大量積累2-酮基-L-古龍酸(2-KLG)的維生素C生產(chǎn)菌株普通生酮古龍酸菌(Ketogulonicigenium vulgaer)WSH-001和巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)WSH-002組成的混菌體系為研究對(duì)象,以提高2-KLG生產(chǎn)效率為目標(biāo),研究了高滲條件下混合菌系細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝特征,氨基酸對(duì)2-KLG生產(chǎn)的作用以及關(guān)鍵氨基酸種類的確定,提出用廉價(jià)明膠代替L-甘氨酸和L-脯氨酸作用的策略,并進(jìn)

2、行1 m3攪拌罐和200 m3氣升發(fā)酵罐放大實(shí)驗(yàn),成功地實(shí)現(xiàn)了維生素C生產(chǎn)效率的提升。主要研究結(jié)果如下:
　　 (1)在詳細(xì)考察了2-KLG工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中滲透壓變化規(guī)律的基礎(chǔ)上,研究了高滲對(duì)混合菌系細(xì)胞生長(zhǎng)和2-KLG合成的影響,提出蔗糖促進(jìn)伴生菌巨大芽胞桿菌生長(zhǎng),進(jìn)而促進(jìn)普通生酮古龍酸菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酸的策略。結(jié)果表明,2-KLG的積累和堿性物質(zhì)(Na2CO3)的流加使?jié)B透壓上升了832 mOsmol/kg;高滲抑制了巨大芽胞桿菌

3、的生長(zhǎng)(15.40％),從而抑制普通生酮古龍酸菌(31.7％)的生長(zhǎng),導(dǎo)致2-KLG產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度分別下降67.5％和69.3％(以1250 mOsmol/kg為例);蔗糖的添加則顯著促進(jìn)巨大芽胞桿菌的生長(zhǎng),使高滲條件下(搖瓶,1250 mOsmol/kg)2-KLG產(chǎn)量(40.6 g/L)提高87％;在3L發(fā)酵罐中,補(bǔ)加10 mmol/L蔗糖使2-KLG發(fā)酵周期縮短10.8％,2-KLG生產(chǎn)強(qiáng)度提高10.4％。
　　 (2)利

4、用蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)技術(shù)并結(jié)合不同批次玉米漿(CSL)對(duì)2-KLG生產(chǎn)的影響,確定了影響2-KLG生產(chǎn)的關(guān)鍵氨基酸種類。結(jié)果表明,巨大芽孢桿菌裂解液使普通生酮古龍酸菌L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-甲硫氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸、L-苯丙氨酸以及L-谷氨酰胺合成途徑中相關(guān)的蛋白(酶)表達(dá)上調(diào);普通生酮古龍酸菌L-組氨酸、L-甘氨酸、L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-甲硫氨酸、L-亮氨酸和L-異亮氨酸從頭合成途徑不完全;在搖瓶分批

5、發(fā)酵添加關(guān)鍵氨基酸L-甘氨酸、L-脯氨酸和L-蘇氨酸時(shí),發(fā)酵周期分別縮短至58 h(縮短17.1％),62 h(縮短11.4％)和60 h(縮短16.7％),2-KLG生產(chǎn)強(qiáng)度分別達(dá)1.12±0.02 g/L/h(提高20.4％),1.04±0.01 g/L/h(提高11.80％)和1.09±0.02 g/L/h(提高17.2％)。
　　 (3)詳細(xì)分析了明膠的組成成分,提出用廉價(jià)明膠代替L-甘氨酸和L-脯氨酸作用的策略,并將實(shí)

6、驗(yàn)結(jié)果在1 m3和200 m3發(fā)酵罐上進(jìn)行放大。結(jié)果表明,明膠中對(duì)2-KLG發(fā)酵有顯著促進(jìn)作用的關(guān)鍵氨基酸-L-甘氨酸和L-脯氨酸在明膠中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)占34.21％;在1 m3攪拌罐上用明膠代替L-甘氨酸和L-脯氨酸的作用時(shí),2-KLG發(fā)酵周期縮短至43 h(縮短15.6％),2-KLG產(chǎn)酸速率提高到1.89 g/L/h(增加25.2％);在200 m3氣升發(fā)酵罐上進(jìn)行明膠生產(chǎn)試驗(yàn),發(fā)酵周期縮短至55 h(縮短8％),2-KLG產(chǎn)量達(dá)到1