基于Au@Fe3O4納米復(fù)合微粒的細(xì)胞分選體系的構(gòu)建.pdf

1、細(xì)胞分選被廣泛用于細(xì)胞生物學(xué)研究、疾病的診斷檢測和治療領(lǐng)域?；诖判晕⒘＿M(jìn)行細(xì)胞分選技術(shù)發(fā)展了三十多年，該方法較傳統(tǒng)方法具有操作方便、分選效果佳、應(yīng)用范圍廣等特點，體系中最重要的影響因素是磁性微粒的類型和性能。與微米級磁性微粒相比，納米級磁性微粒以可穩(wěn)定捕獲細(xì)胞、不影響細(xì)胞活性并可兼容流式細(xì)胞儀，而備受關(guān)注。實際上，基于納米級磁性微粒的細(xì)胞分選有一些關(guān)鍵技術(shù)需要突破。一方面，納米級磁性微粒對外磁場響應(yīng)性較弱，因而對永磁體所具備磁場強(qiáng)度大

2、小有相應(yīng)的適配要求;另一方面，目前廣泛使用的磁性激活的細(xì)胞分選技術(shù)(magnetic activated cell sorting，MACS)必須以可提供強(qiáng)磁場的磁分離柱完成納米級磁性微粒對細(xì)胞的分選。但這種特殊分離裝置價格昂貴，作為一次性耗材有時會被堵塞。因此本研究擬通過對不同組成和構(gòu)型的納米級磁性微粒配合簡便常規(guī)的磁分離裝置在細(xì)胞分選中的應(yīng)用進(jìn)行探索，建立簡便、快速、高效的細(xì)胞分選系統(tǒng)。
　　本人所在團(tuán)隊前期積累了大量的Gol

3、dMag金磁微粒材料及其應(yīng)用研究基礎(chǔ)，基于間接細(xì)胞分選原理，將經(jīng)典核殼結(jié)構(gòu)納米微粒Fe3O4@Au GoldMag NPs (50 nm)、Fe3O4@Au GoldMag NPs (30 nm)，新型花瓣型納米微粒Au@Fe3O4 GoldMag NPs (30 nm)及聚合物包覆磁性微粒Mono-Fe3O4 (50nm)四種納米級磁性微粒修飾鏈親和素(streptavidin，SA)以表面功能化。對上述納米微粒理化性能和SA固定化容

4、量進(jìn)行表征，篩選出適合細(xì)胞分選的納米磁性微粒。后以CD4+T細(xì)胞分選為模型，通過對捕獲抗體、標(biāo)記抗體、磁性微粒用量、細(xì)胞總數(shù)以及磁分離器類型的優(yōu)化，建立CD4+T細(xì)胞分選體系，并與國際知名廠商德國美天旎MACS細(xì)胞分選體系進(jìn)行對比，評估所建立方法的特異性及準(zhǔn)確性。
　　四種不同的磁性微粒經(jīng)表征分析后，優(yōu)選新型花瓣型Au@Fe3O4 GoldMag NPs (30 nm)，生物素化的一抗結(jié)合靶細(xì)胞，通過生物素-鏈親和素結(jié)合靶向錨定目

5、的細(xì)胞，達(dá)到分選目的，與此同時，幾種不同性能的磁分離器也相應(yīng)做了評價。結(jié)果表明，使用DynalMag-Spin磁性分離器，在60μL的標(biāo)記抗體、65μg的磁性微粒的體系中，分選3.5×106人外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMCs)中的CD4+T細(xì)胞，其回收率可達(dá)93.34％，純度可達(dá)95.21％。基于上述建立的細(xì)胞分選系統(tǒng)，我們亦成功實現(xiàn)了CD8+T細(xì)胞的成功分離，其回收率為9

6、4.13％，純度為95.86％。這表明花瓣型金磁微?？勺鳛槿送庵苎庖呒?xì)胞分選的一個普適性載體。此外，在建立乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）作為循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)模型的磁性微粒捕獲體系時，使用新型花瓣型Au@Fe3O4 GoldMag NPs可以在PBS緩沖液或100％新生牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)環(huán)境中捕獲約25個癌細(xì)胞(早期腫瘤患者外周血中CTCs為1-50個