基于脫氧核酶的金屬離子傳感器及基于上轉換發(fā)光納米晶體的生物傳感器設計.pdf

1、本論文的工作分為脫氧核酶型重金屬離子傳感器的設計和稀土上轉換發(fā)光材料的合成及其生物檢測應用兩個部分。
　?、衩撗鹾嗣冈谥亟饘匐x子傳感器方面的應用。
　　脫氧核酶是通過體外篩選技術得到的具有酶活性的小分子單鏈DNA，與天然酶相比，脫氧核酶具有穩(wěn)定、價廉、易于合成和修飾及易于儲存等特點，而且脫氧核酶對特定的金屬離子顯示了高度的特異性識別，其酶活性與特定金屬離子的濃度密切相關，這些特點使其在金屬離子檢測中的應用備受關注。
　

2、　(1)本章中將Pb2+DNAzyme中所使用的底物鏈與酶鏈用兩個胞嘧啶堿基(C)進行連接，成為一條寡核苷酸鏈，并在其5’-端和3’-端分別標記以熒光基團和猝滅基團。在該寡核苷酸鏈形成的分子內二倍體結構當中，熒光基團與猝滅基團緊密接觸，從而保證了高熒光猝滅效率，極大地降低了檢測體系的背景信號，提高了信噪比。同時該檢測體系可以對pb2+的加入作出快速響應，在30秒內檢測體系的熒光信號即可達到穩(wěn)定，從而可以實現(xiàn)Pb2+的快速檢測。利用該方法

3、進行Pb2+的定量檢測，檢測限可以達到3.1nM，遠遠低于歐盟對于飲用水中Pb2+的濃度要求(72 nM)。在這一方法中，單一寡核苷酸探針鏈形成的分子內二倍體結構不僅保證了檢測體系具有較低的背景熒光，其良好的穩(wěn)定性也極大地增加了該傳感器對溫度變化及離子強度變化的耐受能力。實驗結果表明，在500 mM NaCl的存在下，該分子內二倍體結構的解鏈溫度可以達到54.2℃。在4℃、25℃及37℃下用該傳感器進行Pb2+的定量檢測，檢測結果基本相

4、同，表明該傳感器可以應用于更寬的溫度范圍。
　　(2)我們對Cu2+ DNAzyme進行了重構，重構后的結構與之前的DNAzyme結構相似，但是Cu2+的存在卻可以顯示更高的酶活性。在5μM Cu2+和30μM抗壞血酸的存在下，體系可以獲得23倍的熒光信號增長，同時表現(xiàn)出了杰出的靈敏度和選擇性，檢測限為0.6 nM，線性范圍是5-500 nM。Cu2+ DNAzyme傳感器中分子內莖-環(huán)結構的使用不僅有效地保證了檢測體系具有較低的

5、背景熒光，而且莖-環(huán)結構的高穩(wěn)定性(在1.5 M NaCl的存在下解鏈溫度可以達到71℃)還極大地提高了該傳感器對溫度變化及離子強度變化的耐受能力。我們在4℃、20℃、25℃及37℃下使用該傳感器制作了Cu2+檢測的標準曲線，發(fā)現(xiàn)這四個溫度下得到標準曲線幾乎完全重合，說明利用該傳感器可以在4-37℃的溫度范圍內給出近乎相同的檢測結果。同時我們發(fā)現(xiàn)NaCl濃度在0.8-3.0 M時，F(xiàn)/F0基本可以保持不變，也就是說我們設計重構的Cu2+

6、 DNAzyme熒光傳感器可以在0.8-3.0M的離子強度范圍內進行正常工作。
　　(3)本章基于重構的特異性Cu2+ DNAzyme和G-四鏈體DNA酶協(xié)同作用設計了免標記，價格低廉，操作簡單的比色型Cu2+傳感器，使用了可形成G-四鏈體的富G序列及與之互補的部分富C序列，它們分別連接在我們重構的Cu2+ DNAzyme的底物鏈的5’-端及3’-端，由于重構的Cu2+ DNAzyme會形成分子內莖-環(huán)結構，以致富G序列被部分的包

7、埋或部分的形成在該莖-環(huán)結構中，當?shù)孜镦溤贑u2+的存在下被切成兩段之后，G-四鏈體結構形成或者被破壞，在氯化血紅素(Hemin)的存在下酶活性發(fā)生變化，催化H2O2和2，2’-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)氧化反應能力不同?；谶@種原理，設計‘Turn-on’和‘Turn-off’兩種比色型Cu2+傳感器。對于‘Turn-on’型傳感器，由于分子內莖-環(huán)結構的形成可以有效的降低其檢測背景，而且Cu2+ DNAz

8、yme和G-四鏈體-Hemin DNA酶的協(xié)同放大作用，進一步提高了其檢測限，最終其線性范圍為8-200 nM，檢測限為3.9 nM，同時可以實現(xiàn)裸眼檢測。‘Turn-off'模式的原理與‘Turn-on’模式大致相同。雖然‘Turn-off’模式的檢測限不如‘Turn-on’模式低，但是同時結合兩種模式的比色型Cu2+傳感器使用，可以有效的防止假陽性或假陰性結果。同時我們在‘Turn-on’比色型Cu2+傳感器的基礎上利用Hg2+可以

9、與胸腺嘧啶(T)形成金屬堿基對(T-Hg2+-T)的原理來設計新的‘Turn-on’比色型傳感器進行檢測，檢測限達到4.8nM。
　?、蛏限D換發(fā)光納米材料在生物檢測方面的應用。
　　上轉換發(fā)光納米材料是一類吸收低能量光子、發(fā)射高能量光子的新型熒光材料，具有化學穩(wěn)定性好、毒性低、無背景熒光、信噪比高等優(yōu)點，另外在近紅外光激發(fā)下具有組織穿透能力深、對生物組織無損傷、近乎零背景熒光干擾、成像靈敏度高等諸多優(yōu)點，在生物成像和生物分析

10、中有著廣泛的應用前景。
　　(4)本章使用水熱法一步合成了形貌可控，水溶性好，羧基官能團修飾的NaLuF4∶Yb3+/Er3+納米材料，在合成中使用小分子二元酸（丙二酸）作為配體，代替了傳統(tǒng)方法中使用油酸作為配體，這種合成方法不但解決了上轉換納米材料的水溶性問題，而且合成之后的納米晶體表面直接修飾有-COOH官能團，可以和多種生物分子偶聯(lián)，為上轉換發(fā)光納米晶體在生物標記應用中靈敏性和特異性的提高提供了前期基礎。隨后在上轉換納米晶體