基于磁性納米復(fù)合探針檢測水中鉛離子的生物傳感器研制.pdf

1、目的：
　　通過對環(huán)境水體中二價(jià)鉛離子（Pb2+）特異性DNA酶（DNA enzyme，DNAzyme）的篩選，選定對Pb2+特異性高的DNA酶，再通過堿基互補(bǔ)配對原則將磁珠酶鏈復(fù)合體(MB-GR-5E)與納米金底物鏈復(fù)合體(AuNP-HRP-GR-5S)組裝，構(gòu)建一種新型的納米生物傳感器比色法檢測Pb2+，從而建立一種簡便、快速檢測Pb2+的新型檢測方法。
　　方法：
　　1.對環(huán)境水體中Pb2+特異性DNAzyme

2、的篩選:根據(jù)文獻(xiàn)查閱的結(jié)果重點(diǎn)篩選出8-17DNAzyme、GR-5DNAzyme兩種DNAzyme。將此兩種DNAzyme與Pb2+進(jìn)行反應(yīng)，運(yùn)用聚丙烯酰胺(PAGE)凝膠電泳分析其對Pb2+的特異性。
　　2.AuNP-HRP-GR-5S的組裝制備及表征分析:首先將辣根過氧化物酶(peroxidase horseradish，HRP)通過靜電吸附作用與納米金(goldnanoparticals，AuNPs)結(jié)合，再將巰基修飾的

3、底物鏈(GR-5S)以金硫鍵與結(jié)合有HRP的AuNPs相連，最后以牛血清白蛋白封閉納米金表面剩余的結(jié)合位點(diǎn)，至此，功能化的AuNP-HRP-GR-5S即構(gòu)建完畢。利用紫外-可見光吸收光譜對AuNPs及其復(fù)合物進(jìn)行特征性吸收峰表征;利用原子力顯微鏡(AFM)技術(shù)對AuNPs及其復(fù)合體進(jìn)行形貌表征;利用HRP顯色實(shí)驗(yàn)對AuNP-HRP-GR-5S上的HRP進(jìn)行定性定量分析;利用熒光探針雜交實(shí)驗(yàn)對AuNP-HRP-GR-5S上的GR-5S進(jìn)行

4、定性定量分析。
　　3.MB-GR-5E的組裝制備及表征分析:首先使氨基化MBs在戊二醛的作用下發(fā)生氨基基團(tuán)醛基化，再將氨基化修飾的DNA酶鏈GR-5E通過第二次氨基醛基化與MBs穩(wěn)定連接，最后以封閉劑封閉MBs上剩余的醛基化位點(diǎn)，利用2 mol/L的NaCl在48h內(nèi)對MB-GR-5E進(jìn)行老化加固，至此，功能化的MB-GR-5E即構(gòu)建完畢。利用熒光探針雜交實(shí)驗(yàn)對MB-GR-5E上的GR-5E進(jìn)行定性定量分析。
　　4.納米

5、生物傳感器的雜交制備:將制備好的AuNP-HRP-GR-5S與MB-GR-5E以一定的體積比例進(jìn)行混合，置于恒溫振蕩儀中進(jìn)行雜交。雜交至上清溶液開始微紅，提示雜交完畢，后經(jīng)磁分離洗滌，該生物傳感器制備完畢。
　　5.納米生物傳感器檢測的條件優(yōu)化:通過摸索AuNP-HRP-GR-5S與MB-GR-5E的雜交體積比例、雜交時間，雜交后雙鏈與待檢樣品反應(yīng)的體積比例、反應(yīng)時間以及磁分離后上清與TMB反應(yīng)的體積比例、反應(yīng)時間等多個條件，以最

6、高信噪比為判斷標(biāo)準(zhǔn)對該生物傳感器進(jìn)行全面的優(yōu)化。
　　6.該納米生物傳感器對Pb2+的快速檢測:Pb2+特異性識別并切割DNA酶及其底物鏈雜交形成的雙鏈，使生物傳感器發(fā)生解鏈并斷裂，在TMB的作用下能引起磁分離上清（上清中存留僅結(jié)合有HRP的斷裂的底物鏈）顏色和吸收光譜的變化。利用該納米生物傳感器對不同濃度梯度（1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L、1μmol/L、10μmol/L）的Pb2+和其他常見水體金屬離子

7、(Zn2+、Mg2+、Ca2+、Cu2+、Mn2+、Ag+、Ni2+、Fe2+、Co2+、Hg2+)以及陰離子(NO3-、CO3-、Cl-、SO42-、HPO42-、H2PO4-)進(jìn)行檢測，通過肉眼觀察顏色變化和雙波段檢測法(A650-A490)對該納米生物傳感器檢測方法及穩(wěn)定性等進(jìn)行方法學(xué)評價(jià)。
　　結(jié)果：
　　1.對環(huán)境水體中Pb2+特異性DNAzyme的篩選:由PAGE膠結(jié)果篩選出GR-5DNAzyme對Pb2+更具特

8、異性，本文中將其酶鏈命名為GR-5E，相應(yīng)的底物鏈命名為GR-5S。
　　2.AuNP-HRP-GR-5S的組裝制備及表征分析:由紫外-可見光光譜圖發(fā)現(xiàn)本試驗(yàn)中的納米金在520 nm處出現(xiàn)吸收峰，與直徑為15nm納米金的特征性吸收峰相吻合。隨著HRP和GR-5S的依次加入引起特征性吸收峰的依次右移，可初步推斷AuNPs與HRP和GR-5S成功連接。由AFM表征圖發(fā)現(xiàn)裸納米金的粒徑在15nm左右而AuNP-HRP-GR-5S的粒徑在

9、16～17 nm左右，更加明確了AuNP-HRP-GR-5S的成功組裝。由顯色試驗(yàn)結(jié)果分析計(jì)算，發(fā)現(xiàn)每個AuNP表面平均可以連接10～13個HRP分子。由熒光探針雜交試驗(yàn)結(jié)果分析計(jì)算，發(fā)現(xiàn)每個AuNP表面平均可以連接16個GR-5S。
　　3.MB-GR-5E的組裝制備及表征分析:由熒光探針雜交試驗(yàn)結(jié)果分析計(jì)算，發(fā)現(xiàn)1μg MBs表面大約可以結(jié)合0.53 pmol的GR-5E。
　　4.納米生物傳感器的雜交制備:由AuNP-

10、HRP-GR-5S與MB-GR-5E雜交前后磁分離得到的上清溶液從深紅到微紅再到無色透明的顏色變化，可以初步確定兩者最適的雜交比例，同時結(jié)合最高信噪比這一判斷標(biāo)準(zhǔn)，從而制備出本實(shí)驗(yàn)中性價(jià)比最高的納米生物傳感器。
　　5.生物傳感器的條件優(yōu)化:對本納米生物傳感器的各項(xiàng)檢測條件進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)AuNP-HRP-GR-5S與MB-GR-5E在體積比為5∶1，雜交時間為25min時剛好達(dá)到飽和雜交;組裝好的傳感器與待檢樣品在體積比為1∶1，

11、反應(yīng)時間為30min，磁分離后上清液與3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺體積比為1∶3，反應(yīng)時間為15min時檢測出的信噪比最高，說明以上條件為最佳檢測條件。
　　6.該納米生物傳感器對Pb2+的快速檢測:在條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，對不同濃度梯度的Pb2+和其他常見水體金屬離子以及陰離子進(jìn)行檢測。通過磁分離后上清顏色的變化和雙波段檢測法計(jì)算ΔA(ΔA=A650-A490)的值分析發(fā)現(xiàn):該納米生物傳感器特異性良好，基本不與其他常見水體金屬離

12、子以及陰離子發(fā)生交叉反應(yīng)，且能在混合金屬離子以及混合陰離子溶液中檢出Pb2+;靈敏度較高，對Pb2+的最低檢測限為32 pmol/L（國家標(biāo)準(zhǔn)飲用水Pb2+濃度上限4.8nmol/L），已處于目前同類傳感器較高水平;檢測過程只需要約一個小時，相比大型儀器至少需2個小時，操作簡便，且在Pb2+濃度高時無需使用檢測儀器，肉眼即可獲得定性的檢測結(jié)果;穩(wěn)定性較好，可在16天（4℃保存）內(nèi)保持分析結(jié)果基本一致，并可在約3個月內(nèi)保持實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定下

13、降趨勢，根據(jù)不同時間點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線可測量Pb2+濃度。
　　結(jié)論：
　　本研究通過篩選出對Pb2+特異性高的DNAzyme，并分別組裝AuNP-HRP-GR-5S與MB-GR-5E，將兩者雜交制備成所需的納米生物傳感器，經(jīng)過條件的優(yōu)化實(shí)現(xiàn)了對Pb2+的高特異性和高靈敏度檢測，并可在16天（4℃保存）內(nèi)穩(wěn)定檢測，檢測時間可達(dá)3個月之久，操作簡便、部分結(jié)果無需借助大型檢測儀器，大大縮短了檢測時間，同時也為其他水體重金屬離子的檢測提