總狀蕨藻硫酸多糖的提取、分離及其抗腫瘤與免疫活性.pdf

1、大量研究表明，海藻的主要成分——硫酸多糖具有抗病毒、抗凝血、降血脂、抗腫瘤與免疫調(diào)節(jié)等多種生理功能，但至目前為止，研究的海藻硫酸多糖主要來源于紅藻與褐藻，來源于綠藻的極少?？偁钷г?Caulerparacemosa)屬綠藻門(chlorophyta)蕨藻科植物，是世界性的熱帶藻類，不僅廣泛分布于我國的臺灣、海南和廣東，還分布于日本、馬來半島和太平洋東岸等地，產(chǎn)量高，但目前尚未得到充分利用。為了充分認(rèn)識與高值化利用該資源提供科學(xué)依據(jù)，本文

2、對其硫酸多糖的提取、分離、理化性質(zhì)、抗腫瘤與免疫活性進(jìn)行了初步研究。 本文的主要工作及結(jié)果如下： 1.在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用正交實(shí)驗(yàn)，確定了總狀蕨藻多糖的提取工藝與工藝參數(shù)?？偁钷г宥嗵翘崛」に嚍椋簾崴c蛋白酶酶解相結(jié)合提取。工藝參數(shù)為固液比1∶10，蛋白酶用量136.5U/g，60℃酶法提取2.5h后，再將固液比調(diào)至1∶20，在溫度95℃條件下繼續(xù)進(jìn)行熱水提取2.5h，多糖得率為6.7﹪，比單純熱水提取時的多糖得率提

3、高了131.0﹪，還大大簡化了后續(xù)繁瑣的除蛋白工藝。 2.熱水與蛋白酶酶解相結(jié)合浸提得到的總狀蕨藻多糖提取液經(jīng)Sevage法和透析法等步驟初步純化后得到的總狀蕨藻硫酸多糖(CaulerpaRacemosaSulfatedPolysaccharide，簡稱為CRSP1)；以DEAE-52纖維素為固定相和不同濃度的NaCl為流動相對CRSP1進(jìn)行分段洗脫，分別得到0.5M和1.0MNaCl洗脫的兩個主要級分CRSP1A和CRSP1B

4、。 3.采用苯酚-硫酸法、硫酸-咔唑法、Folin-酚法和BaCl2-明膠法分別對CRSP1、CRSP1A和CRSP1B的中性糖含量、糖醛酸含量、蛋白質(zhì)含量和硫酸基含量進(jìn)行了測定；采用氣相色譜法分析了CRSP1、CRSP1A和CRSP1B的單糖組分；采用氨基酸自動分析儀分析了CRSP1、CRSP1A和CRSP1B的氨基酸組成；采用Sepharose4B凝膠柱測定了CRSP1A和CRSP1B的分子量分布?；瘜W(xué)組成測定結(jié)果顯示，CR

5、SP1、CRSP1A和CRSP1B的中性糖含量分別為53.7﹪、36.0﹪和45.1﹪，糖醛酸含量分別為7.9﹪、3.9﹪和7.6﹪，蛋白質(zhì)含量分別為9.9﹪、14.0﹪和2.0﹪，硫酸基含量分別為27.6﹪、45.6﹪和48.3﹪；氣相色譜分析結(jié)果顯示，CRSP1由11.4﹪甘露糖、56.8﹪葡萄糖和31.8﹪半乳糖組成，CRSP1A由10.9﹪甘露糖和89.1﹪葡萄糖組成，CRSP1B由0.8﹪葡萄糖和99.2﹪半乳糖組成；氨基酸分

6、析結(jié)果顯示，CRSP1、CRSP1A和CRSP1B中的氨基酸組成相似，天門冬氨酸和谷氨酸含量異常高，其次是丙氨酸、甘氨酸和纈氨酸，色氨酸和組氨酸含量最低；分子量測定結(jié)果表明，CRSP1A和CRSP1B是至少含有兩個組分的混合物，CRSP1A由分子量為136.5×104和14.4×104的兩部分組成，CRSP1B由分子量為14.4×104和9.9×104的兩部分組成。 4.采用MTT法檢測了未去游離蛋白總狀蕨藻多糖CRSP、去游離

7、蛋白多糖CRSP1以及CRSP1A和CRSP1B對K562細(xì)胞增殖的抑制作用，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用灌胃給藥觀察了CRSP和CRSP1對小鼠H22實(shí)體瘤的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CRSP和CRSP1在體內(nèi)外均具有抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用，并且在相同劑量條件下，CRSP1的抗腫瘤活性明顯強(qiáng)于CRSP的抗腫瘤活性；CRSP1、CRSP1A和CRSP1B在體外對K562細(xì)胞生長都具有顯著抑制作用，同劑量下CRSP1的抑制率最高，其次是CRSP1A，CRSP1

8、B的抑制率最低，其中CRSP1和CRSP1A在中劑量的抑制率達(dá)到最高值，而CRSP1B的抑制率隨著劑量的增加呈遞減趨勢。 5.采用腹腔注射與灌胃兩種方式給藥，觀察了CRSP1對小鼠S180肉瘤的抑制作用以及對小鼠免疫器官和碳廓清指數(shù)的影響，結(jié)果顯示，CRSP1采用腹腔注射與灌胃兩種方式給藥，對小鼠S180肉瘤均具有顯著的抑制作用，且腹腔注射能顯著地增加小鼠的脾臟指數(shù)，灌胃給藥能顯著升高小鼠碳廓清指數(shù)。這些事實(shí)表明，增強(qiáng)機(jī)體的免疫

9、功能可能是總狀蕨藻多糖抗腫瘤作用的機(jī)制之一。 6.采用體外免疫試驗(yàn)方法檢測了CRSP1、CRSP1A和CRSP1B直接或協(xié)同有絲分裂原ConA對正常小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖作用以及其對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅和分泌一氧化氮的影響。結(jié)果顯示，三者在一定劑量范圍內(nèi)，直接或協(xié)同有絲分裂原ConA對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖均有一定的促進(jìn)作用，還能夠有效地促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞MΦ吞噬中性紅和分泌NO的數(shù)量，說明CRSP1、CRSP1A和CRSP1