人腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（hBDNF）的克隆與表達(dá).pdf

1、人腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(human brain-derived neurotrophic factor,hBDNF)是一種可溶性的蛋白質(zhì),能夠促進(jìn)并增強(qiáng)多種神經(jīng)元的存活和分化,而且對(duì)受損神經(jīng)元有修復(fù)作用.早老性癡呆、帕金森、糖尿病神經(jīng)病等一直是困擾人類的神經(jīng)疾病,目前還沒有針對(duì)性的藥物.該研究利用生物工程方法表達(dá)了人類神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF蛋白,為治療該類疾病提供了新的思路.一、原核重組質(zhì)粒pET32-BDNF的構(gòu)建和表達(dá).該研究首先采用逆

2、轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR),以人的血液淋巴細(xì)胞總RNA為模板,擴(kuò)增了人的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(hBDNF)成熟序列的cDNA片段;分別在上下游引物中引入了Nde I和BamH I的酶切位點(diǎn),克隆到pMD18-T中得到重組質(zhì)粒pMD18-BDNF;利用PCR和酶切方法篩選陽性克隆,經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證,其序列與GenBank上載錄的一致.用BamH I和Nde I酶切pMD18-BDNF,回收363bp的BDNF基因片段,定向插入到原核重組質(zhì)

3、粒pET32-BDNF,分別用BamH I單酶切和BamH I/Nde I雙酶切鑒定.鑒定正確后的重組子pET32-BDNF轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),利用IPTG誘導(dǎo)原核重組載體獲得融合蛋白;SDS-PAGE分析表明,大腸桿菌表達(dá)菌株經(jīng)1mmol/L IPTG誘導(dǎo)4h后,可表達(dá)一單體分子量為14kD的蛋白質(zhì),表達(dá)量約為菌體總蛋白的15.8﹪,Western blotting檢測(cè)表明該表達(dá)產(chǎn)物具有免疫活性.二、真核重組質(zhì)粒pPIC9

4、K-BDNF的構(gòu)建和表達(dá).以上面測(cè)序得到的重組質(zhì)粒pMD18-BDNF為模板,擴(kuò)增了hBDNF基因片段,分別在上下游引物中引入了SnaB I和EcoR I的酶切位點(diǎn).為了避免PCR擴(kuò)增的突變,將BDNF再次克隆到pMD18-T中得到重組質(zhì)粒T-BDNF,酶切篩選得到12個(gè)陽性克隆.經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證,得到一個(gè)序列完全正確的BDNF基因片段.用SnaB I和EcoR I酶切重組質(zhì)粒T-BDNF,回收391bp的BDNF基因片段,定向插入到真核重組