黃花棘豆抗逆轉(zhuǎn)錄因子OoNAC72的克隆及功能初步分析.pdf

1、黃花棘豆作為中國(guó)西部草原地區(qū)的主要毒害草之一，給畜牧業(yè)和生態(tài)環(huán)境造成巨大損失和破壞。黃花棘豆優(yōu)勢(shì)分布區(qū)多為干旱少雨且寒冷的地區(qū)，其迅速蔓延與自身極強(qiáng)的抗逆性密切相關(guān)。因此，對(duì)其抗逆機(jī)理研究成為解析黃花棘豆蔓延機(jī)制的重要突破點(diǎn)。但目前研究主要集中在分布情況的調(diào)查統(tǒng)計(jì)、化感作用和毒理研究等方面，尚未觸及抗逆機(jī)理研究。研究表明逆境脅迫下轉(zhuǎn)錄因子參與的轉(zhuǎn)錄調(diào)控對(duì)植物生長(zhǎng)至關(guān)重要，而NAC轉(zhuǎn)錄因子又是植物特有的廣泛參與各種逆境脅迫的重要轉(zhuǎn)錄因子。

2、因此，本研究以NAC轉(zhuǎn)錄因子為切入點(diǎn)，充分利用已經(jīng)獲得的黃花棘豆轉(zhuǎn)錄組差異基因的數(shù)據(jù)，篩選出響應(yīng)逆境脅迫關(guān)鍵NAC轉(zhuǎn)錄因子，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析、生物學(xué)特征分析、表達(dá)譜分析和功能驗(yàn)證等方面的研究，以明確其調(diào)控方式與途徑，進(jìn)而從轉(zhuǎn)錄調(diào)控層面來(lái)探究黃花棘豆的分子抗逆機(jī)制，以期為解析其蔓延的內(nèi)在機(jī)制提供新的依據(jù)。
　　(1)根據(jù)黃花棘豆轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，確定注釋為NAC轉(zhuǎn)錄因子的Unigene comp71824為研

3、究目標(biāo)。隨后利用primer5軟件設(shè)計(jì)特異引物，從黃花棘豆幼苗中成功克隆到該基因，命名為OoNAC72。OoNAC72基因序列全長(zhǎng)1376bp，ORF為996bp，密碼子起始位點(diǎn)在49bp位置，密碼子終止位點(diǎn)在1045bp位置，編碼331個(gè)氨基酸。利用NCBI的BlastX分析，結(jié)果顯示黃花棘豆OoNAC72的N端含有一個(gè)長(zhǎng)122(98～220)個(gè)氨基酸的NAM結(jié)構(gòu)域，屬于典型NAC轉(zhuǎn)錄因子。
　　(2)對(duì)克隆得到的黃花棘豆OoN

4、AC72基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)黃花棘豆OoNAC72蛋白不具有跨膜結(jié)構(gòu)域，不存在信號(hào)肽，強(qiáng)親水性極強(qiáng)，推測(cè)其定位在細(xì)胞核內(nèi)。OoNAC72蛋白含有7個(gè)糖基化位點(diǎn)和19個(gè)磷酸化位點(diǎn)。和已知NAC家族蛋白比對(duì)發(fā)現(xiàn)該蛋白在NAM結(jié)構(gòu)域高度保守，而NAM結(jié)構(gòu)域以外的部分具有較高多態(tài)性，同時(shí)NAM結(jié)構(gòu)域可以被分為A～E五個(gè)亞區(qū)域，進(jìn)化樹(shù)顯示該蛋白與蒺藜苜蓿、鷹嘴豆相似度最高，親緣關(guān)系最近。
　　(3)構(gòu)建了pCAMBI1302-O

5、oNAC72-eGFP植物融合表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法進(jìn)行對(duì)OoNAC72進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果顯示OoNAC72分布于煙草表皮細(xì)胞的細(xì)胞核中。同時(shí)，構(gòu)建pGBKT7-OoNAC72酵母重組載體，通過(guò)酵母單雜交實(shí)驗(yàn)對(duì)OoNAC72轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄激活活性分析，結(jié)果表明OoNAC72具有轉(zhuǎn)錄激活活性。整個(gè)生物學(xué)特征分析表明OoNAC72符合轉(zhuǎn)錄因子的基本特征。
　　(4)運(yùn)用qRT-PCR方法對(duì)黃花棘豆OoNAC72

6、基因在干旱、高鹽、低溫脅迫處理與脫落酸、乙烯、赤霉素三種激素處理下的表達(dá)譜進(jìn)行分析，結(jié)果顯示:干旱、高鹽、低溫非生物脅迫均可顯著誘導(dǎo)OoNAC72基因的表達(dá);激素處理下受脫落酸高效誘導(dǎo)表達(dá)，而乙烯和赤霉素處理對(duì)OoNAC72基因的表達(dá)影響不顯著。結(jié)果表明，OoNAC72基因可能通過(guò)依賴(lài)ABA的信號(hào)途徑參與黃花棘豆對(duì)逆境脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。
　　(5)通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蘸花法遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥(Col-0)，T1代轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)潮霉素培養(yǎng)基的篩