催化水解亞氨基二乙腈生產(chǎn)亞氨基二乙酸菌株的誘變及發(fā)酵條件優(yōu)化.pdf

1、亞氨基二乙酸是一種重要的精細(xì)化工中間體，其用途廣泛，其中最主要的用途就是用于生產(chǎn)除草劑草甘膦。目前，亞氨基二乙酸法生產(chǎn)草甘膦是世界上主流的生產(chǎn)方法，因此其需求量將越來(lái)越大。而亞氨基二乙酸的生產(chǎn)都是采用化學(xué)法生產(chǎn)，包括：氫氰酸法、氯乙酸法、二乙醇胺法、亞氨基二乙腈水解法等主要合成工藝，但是這些方法一般都是污染嚴(yán)重、成本高、收率低。利用腈水解酶法生產(chǎn)亞氨基二乙酸具有反應(yīng)條件溫和、環(huán)境污染小、成本較低等優(yōu)點(diǎn)。而酶法生產(chǎn)亞氨基二乙酸面臨的主要問(wèn)

2、題是腈水解酶酶活不高，需通過(guò)菌種改良或構(gòu)建基因工程菌的方法以得到具有較高腈水解酶酶活的菌株。本論文以生物合成產(chǎn)物亞氨基二乙酸為研究對(duì)象，詳細(xì)探討了產(chǎn)物的分離及表征，Alcaligenes foecalis ZJB09133菌株的誘變育種以及高產(chǎn)菌株的發(fā)酵條件優(yōu)化。
　　 論文首先對(duì)亞氨基二乙腈的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行提取和表征。利用紅外光譜、質(zhì)譜、核磁共振等技術(shù)對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果顯示，亞氨基二乙腈水解得到的產(chǎn)物確為亞氨

3、基二乙酸。在亞氨基二乙酸轉(zhuǎn)化液中加入2％的活性炭，在50℃下攪拌脫色1 h，脫色率達(dá)到93.4％。當(dāng)甲醇加入量是母液的2倍時(shí)，純度達(dá)到最高的98.3％，收率也基本達(dá)到最大。當(dāng)采用程序降溫的方式結(jié)晶時(shí)，得到產(chǎn)品為晶體，晶體形狀為單斜晶體。使用上述方法得到的重結(jié)晶樣品純度達(dá)到98.8％，收率為40.2％。
　　 以本實(shí)驗(yàn)室篩選并保藏的Alcaligenes faecalis ZJB09133為出發(fā)菌株，采用UV、UV-LiCl、等離

4、子進(jìn)行誘變處理，當(dāng)紫外的照射時(shí)間和離子注入量分別為15 s和60×2.3×1013 ions/cm2時(shí)，正突變是最高，分別達(dá)到20％和22％。在挑取的所有菌落中，最終得到了3株腈水解酶酶活最高的菌株，且經(jīng)過(guò)連續(xù)5代的傳代培養(yǎng)，酶活沒(méi)有明顯的下降，其中UL144酶活是最高的，達(dá)到58.8 U/g DCW，比初始菌株酶活提高了77.1％。
　　 對(duì)誘變后的高產(chǎn)菌株Alcaligenes faecalis UL144以單因素法進(jìn)行培養(yǎng)