表達TNFR-Fc的CHO-GS細胞無血清培養(yǎng)基優(yōu)化及流加工藝設計.pdf

1、腫瘤壞死因子受體-Fc抗體融合蛋白TNFR-Fc在治療風濕性、類風濕性關節(jié)炎方面具有很好的療效，但是由于對TNFR-Fc日益增長的需求與其價格昂貴、哺乳動物細胞表達抗體融合蛋白能力低的矛盾限制了其在治療和診斷方面的使用。因此，針對表達TNFR-Fc抗體融合蛋白的CHO-GS細胞，設計一種成本較低的無血清培養(yǎng)基，并且建立經濟高效的流加培養(yǎng)工藝，對于TNFR-Fc抗體融合蛋白成功邁向產業(yè)化很重要。
　　 ㈠CHO-GS細胞無血清培養(yǎng)

2、基的優(yōu)化：⑴氨基酸濃度的優(yōu)化。通過對CHO-GS細胞在商業(yè)化的EX-CELLTM302培養(yǎng)基中的氨基酸代謝分析，優(yōu)化基礎無血清培養(yǎng)基(SFM)中的氨基酸濃度，結果如下：Asp，20 mg/l；Thr，180 mg/l；Ser，25 mg/l；Glu，40 mg/l；Cys，30 mg/l；Val，50 mg/l；Met，50 mg/l；Ile，50 mg/l；Leu，60 mg/l；Tyr，40 mg/l；Phe，60 mg/l；Lys

3、，60 mg/l；His，30 mg/l；Trp，30 mg/l；Pro，70 mg/l；⑵Plackett-Burman篩選主要影響因素。依據Plackett-Burman實驗設計，評估乙醇胺，亞硒酸鈉，腐胺，氫化可的松，脂類，丙酮酸鈉，谷胱甘肽，氯化膽堿，D-泛酸鈣，葉酸，煙酰胺，鹽酸吡咯醛，核黃素，鹽酸硫胺，氯鈷胺素和肌醇十七中因子對CHO-GS細胞生長和蛋白表達的影響。統(tǒng)計分析結果表明腐胺，乙醇胺，脂類，丙酮酸鈉，氯化膽堿及泛酸

4、鈣對細胞生長有積極作用，同時腐胺(p<0.01)對蛋白表達也有重要的促進作用；而亞硒酸鈉，抗壞血酸，谷胱甘肽，核黃素和肌醇對細胞生長有抑制影響；⑶中心組合試驗設計確定重要因子的最優(yōu)濃度。通過中心組合實驗設計，確定了最大抗體生產量時脂類、腐胺和檸檬酸鐵銨的濃度，分別為：0.5×，1.5 mg/l和0.75 mM；⑷通過實驗設計獲得的CHO-SFM，最大細胞密度為3.5×106/ml，較基礎培養(yǎng)基提高了84％：TNFR-Fc終產量為85.5

5、9 mg/l，較基礎培養(yǎng)基提高了9.3倍。
　　 ㈡CHO-GS細胞在CHO-SFM與EX-CELLTM302培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)的生長代謝及抗體表達特性。結果表明：細胞在CHO-SFM與EX-CELLTM302中獲得的最大細胞密度分別為3.73×106 cells/ml和3.64×106cells/ml，兩者沒有很大差別；CHO-SFM中的細胞比生產率(7.97mg/109cell/day)較EX-CELLTM302(6.70 m

6、g/109cell/day)提高了19％；CHO-SFM的終抗體產量(90.95 mg/l)較EX-CELLTM302(76.95 mg/l)提高了18％；兩者的唾液酸含量分別為61.8μg/mg和62.1μg/mg，均符合TNFR-Fc合格的標準。
　　 ㈢CHO-GS細胞在CHO-SFM培養(yǎng)基中的適應性及穩(wěn)定性分析。細胞在CHO-SFM中能夠很快地適應，連續(xù)傳代25天，細胞依然能夠很好地增殖并且保持較高的活力，比生長速率μ基