酵母底盤細(xì)胞中7-脫氫膽甾醇的模塊化設(shè)計與合成.pdf

1、7-脫氫膽甾醇不僅是重要的甾體激素中間體,還是合成維生素D3的關(guān)鍵前體,更可以作為制備膽甾相液晶的原料,具有明顯的藥用效果和廣闊的市場前景。傳統(tǒng)的7-脫氫膽甾醇制備方法主要是化學(xué)合成法,但由于化學(xué)法工藝流程長,反應(yīng)步驟多,收率低,副產(chǎn)物去除過程復(fù)雜,能耗高且易對環(huán)境造成嚴(yán)重污染,極大限制了7-脫氫膽甾醇的生產(chǎn)和應(yīng)用。雖然也有關(guān)于酶促生化反應(yīng)生產(chǎn)7-脫氫膽甾醇的相關(guān)報道,但成本問題始終制約了該技術(shù)的工業(yè)化應(yīng)用。利用生物技術(shù)合成7-脫氫膽甾

2、醇可以解決以上的困難,國外已有課題組實現(xiàn)7-脫氫膽甾醇的生物全合成,但利用合成生物技術(shù)構(gòu)建7-脫氫膽甾醇人工合成細(xì)胞,并對7-脫氫膽甾醇合成功能模塊與底盤細(xì)胞的適配關(guān)系進(jìn)行研究,目前還沒有相關(guān)的報道。
　　本研究利用合成生物學(xué)技術(shù),從7-脫氫膽甾醇合成功能模塊的構(gòu)建和改造、酵母底盤細(xì)胞的優(yōu)化兩方面,注重挖掘功能模塊與底盤細(xì)胞間的適配關(guān)系,降低酵母底盤細(xì)胞的代謝壓力,提高與功能模塊的適配性,從而增加7-脫氫膽甾醇產(chǎn)量。本課題主要包括

3、三部分工作:過表達(dá)酵母固醇合成途徑中的內(nèi)源基因tHMGR、ERG1,敲除非必需基因ERG6、ERG5以抑制酵母固醇向麥角固醇的轉(zhuǎn)化,通過對模塊內(nèi)不同強(qiáng)度啟動子的考察,得到優(yōu)選的改造后酵母底盤SyBE_000956;引入人體來源的固醇C-24還原酶,同時過表達(dá)內(nèi)源基因ERG3、ERG2,得到9個7-脫氫膽甾醇合成功能模塊;將構(gòu)建的功能模塊導(dǎo)入底盤細(xì)胞,得到36株7-脫氫膽甾醇人工合成細(xì)胞,通過對不同強(qiáng)度啟動子、改造后的不同底盤細(xì)胞等指標(biāo)的

4、考察,研究外源功能模塊與底盤細(xì)胞間的適配機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn):底盤細(xì)胞相同的情況下,不同強(qiáng)度的啟動子與底盤細(xì)胞的適配性由好到差依次為TDH3p、PGK1p、TDH1p;只包括單個基因元件DHCR24的功能模塊構(gòu)成的人工細(xì)胞7-脫氫膽甾醇的產(chǎn)量高于大部分包括基因元件ERG3、ERG2、DHCR24的功能模塊所構(gòu)成的人工細(xì)胞;外源功能模塊相同的情況下,以優(yōu)化后的SyBE_000956為底盤的人工合成細(xì)胞,7-脫氫膽甾醇含量最高,與功能模塊的適配性