酸馬奶傳統(tǒng)發(fā)酵過(guò)程的宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化研究.pdf

1、中國(guó)馬業(yè)正處在從傳統(tǒng)馬業(yè)向現(xiàn)代馬業(yè)轉(zhuǎn)型的過(guò)渡期，而產(chǎn)品馬業(yè)發(fā)展是現(xiàn)代馬業(yè)的重要組成部分，包括馬肉、馬奶、馬血、馬尿等天然、綠色、營(yíng)養(yǎng)、保健等高附加值的馬產(chǎn)品開(kāi)發(fā)。馬乳產(chǎn)品，尤其是酸馬奶的開(kāi)發(fā)利用擁有廣闊的發(fā)展前景。酸馬奶在我國(guó)有2000年的歷史，不僅必需脂肪酸、不飽和脂肪酸含量高，宜于人體消化吸收，還具有降血壓，降血脂，治療肺結(jié)核、貧血、心血管疾病及消化道疾病等醫(yī)藥保健價(jià)值，非常符合現(xiàn)代人的消費(fèi)需求。然而，對(duì)酸馬奶的大量研究中缺乏對(duì)其傳

2、統(tǒng)發(fā)酵過(guò)程的關(guān)注。了解發(fā)酵過(guò)程中酸馬奶微生物的群落結(jié)構(gòu)與功能基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，可以優(yōu)化群落結(jié)構(gòu)、調(diào)整群落功能具有重要意義，還能為酸馬奶食品安全、臨床應(yīng)用、改進(jìn)傳統(tǒng)發(fā)酵的可控性等研究提供理論依據(jù)。本研究以3.5L體系進(jìn)行酸馬奶發(fā)酵，每隔2.5h搗拌300次，一天共搗拌1500次，發(fā)酵溫度保持在22±2℃范圍內(nèi)，以此條件發(fā)酵96h，每隔12h取一次樣品為后續(xù)研究做準(zhǔn)備。首先對(duì)各時(shí)期的酸馬奶樣品進(jìn)行部分生理生化指標(biāo)測(cè)定分析，初步了解發(fā)酵過(guò)程

3、中的變化情況;其次，從發(fā)酵過(guò)程中選取六個(gè)時(shí)期的樣品，提取宏基因組DNA，PCR擴(kuò)增16S rDNA進(jìn)行454焦磷酸測(cè)序，從而分析發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)演替變化;最后，選取發(fā)酵過(guò)程中的12h、48h和96h三個(gè)樣品進(jìn)行RNA-Seq高通量測(cè)序，構(gòu)建酸馬奶宏轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)，分析了解在發(fā)酵過(guò)程中功能基因表達(dá)情況。主要研究結(jié)果如下:
　　1.酸馬奶發(fā)酵過(guò)程中pH值為下降趨勢(shì)，發(fā)酵前期變化差異顯著，最低達(dá)到3.54;總蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸、脂肪

4、酸含量發(fā)酵過(guò)程中均有增長(zhǎng)趨勢(shì)，到72h達(dá)到最高值;發(fā)酵過(guò)程中乳糖含量減少，而乳酸含量增加。葡萄糖、半乳糖、乙酸、丙酸含量在發(fā)酵過(guò)程中處于較低的水平。丁酸在各個(gè)時(shí)期都未檢測(cè)到。
　　2.酸馬奶在發(fā)酵的初期細(xì)菌多樣性最高，隨著發(fā)酵下降;細(xì)菌的豐度最高值在發(fā)酵的72h時(shí)出現(xiàn)。
　　3.硬壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）為酸馬奶中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門。發(fā)酵過(guò)程中，12h、24h和48h的硬壁菌門含量呈

5、現(xiàn)出上升的趨勢(shì)，而72h和96h時(shí)其含量又呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì);變形菌門的細(xì)菌變化呈現(xiàn)出相反的趨勢(shì)。
　　4.在酸馬奶制作過(guò)程中乳桿菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）為其優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，12h、24h乳桿菌屬(Lactobacillus)的含量呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)，而72h和96h時(shí)其含量又呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì);乳球菌屬（Lactococcus）隨著發(fā)酵含量呈現(xiàn)上升的趨勢(shì);在發(fā)酵的后期，醋酸

6、菌屬(Acetobacter)的含量呈現(xiàn)出增加趨勢(shì)。
　　5.進(jìn)行酸馬奶三個(gè)發(fā)酵時(shí)期(12h、48h、96h)宏轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序，獲得了12.2G的高質(zhì)量短序列，組裝出64,210個(gè)merge-Unigenes，其中59,339條Unigenes可以直接確定其CDS區(qū)及序列方向。其余序列用ESTscan軟件進(jìn)行編碼區(qū)預(yù)測(cè)，有2,230條Unigenes可能為新的蛋白編碼序列。
　　6.對(duì)merge-Unigenes的GO功能

7、分類分析結(jié)果顯示，發(fā)酵過(guò)程與metabolicprocess、catalytic activity及cellular process等密切相關(guān);通過(guò)COG功能分類結(jié)果顯示，酸馬奶的發(fā)酵過(guò)程中，參與Amino acid transport and metabolism的相關(guān)基因和replication, recombination and repair的相關(guān)基因起到了關(guān)鍵的調(diào)控作用;KEGG代謝通路分析，在發(fā)酵過(guò)程中Metabolic p

8、athways、Biosynthesis of secondary metabolites及Microbial metabolism in diverse environments通路是主要的信號(hào)通路。
　　7.差異表達(dá)基因GO功能富集分析結(jié)果顯示，發(fā)酵初期到發(fā)酵中期，metabolicprocess、cellular process、organic substance metabolic process是主要的生物學(xué)過(guò)程，同時(shí)與

9、organic cyclic compound binding、heterocyclic compound binding、small moleculebinding等分子功能基因表達(dá)活躍;自發(fā)酵中期到發(fā)酵末期，cellular process、cellularmacromolecule metabolic process、single-organism cellular process等生物學(xué)過(guò)程相關(guān)基因起到?jīng)Q定性作用，structu

10、ral molecule activity、structural constituent of ribosome、protein binding等分子功能相關(guān)基因表達(dá)活躍。
　　8.差異表達(dá)基因KEGG pathway富集分析，發(fā)酵初期到發(fā)酵中期，Ribosomepathways是這一時(shí)期的主導(dǎo)代謝通路;自發(fā)酵中期到發(fā)酵末期，Ether lipid metabolism、Aminobenzoate degradation、Ster