姜根莖中植源性凝乳酶的分離純化、特性研究及其在奶酪生產(chǎn)中的應(yīng)用.pdf

1、奶酪在人類飲食中有著悠久的歷史。在古代，奶酪是牛奶延長貨架期的一種主要產(chǎn)品形式。奶酪中的高脂肪和高蛋白讓它成為一種高能量和富含營養(yǎng)的食物。如今，奶酪消費(fèi)廣泛分布在世界各地。凝乳酶是奶酪生產(chǎn)中一種最主要的活性劑。在凝乳酶的制備中，小牛皺胃酶是第一個(gè)，也是目前應(yīng)用最廣泛的。
　　 奶酪生產(chǎn)在世界范圍內(nèi)廣泛增加，但隨著小牛皺胃酶供應(yīng)的減少、宗教原因(例如，伊斯蘭教和猶太教)、飲食(素食主義)以及禁令基因重組小牛皺胃酶(在法國、德國和荷

2、蘭)，使得對牛奶凝乳酶替代品有了更大的需求。通過基因工程細(xì)菌和霉菌生產(chǎn)的微生物皺胃酶已經(jīng)被證明適合作為動物皺胃酶的替代品，但更令我們感興趣的是一些植物來源的天然皺胃酶。
　　 由于動物皺胃酶的使用受到限制，所以植物凝乳酶的使用有助于提高這些人對于奶酪的生產(chǎn)。雖然一些植物來源的蛋白水解酶能夠凝乳，但可惜的是用于生產(chǎn)奶酪的大部分植物皺胃酶的使用被認(rèn)為是不恰當(dāng)?shù)模驗(yàn)樗倪^度水解特性會降低奶酪最后的產(chǎn)量，同時(shí)也由于這種方式生產(chǎn)的奶酪最

3、后會產(chǎn)生苦澀的口味，因而也限制了其使用。隨后，為了滿足工業(yè)良性增長以及順應(yīng)全球?qū)Χ嘣獌?yōu)質(zhì)的奶酪生產(chǎn)需求，從植物中提取新的牛奶蛋白凝乳酶的探索仍然在繼續(xù)。
　　 該研究報(bào)告主要內(nèi)容包括：(1)優(yōu)化牛奶凝乳劑--姜蛋白酶的萃取條件，(2)從姜的根莖得到的新型牛奶凝乳劑--半胱氨酸蛋白酶的特性和純化，(3)姜蛋白酶、木瓜蛋白酶和小牛皺胃酶對牛奶凝乳的影響，(4)在奶酪的生產(chǎn)過程中利用姜蛋白酶和小牛皺胃酶進(jìn)行蛋白水解，(5)用姜蛋白酶和

4、小牛皺胃酶制備的Peshawari奶酪的物理化學(xué)、微生物和感官特性評價(jià)。主要研究結(jié)果如下：
　　 (1)工藝參數(shù)的優(yōu)化。即均質(zhì)時(shí)間(1-3 min，X1)，緩沖pH(6-8，X2)，緩沖液體積(50-100 mL，X3)，包括從姜的根莖液體提取得到的蛋白水解酶，通過響應(yīng)面方法研究牛奶凝乳現(xiàn)象。二次模型應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，我們得到了平均酶活性及其描述方程。將姜的根莖在76 mL，pH為7的緩沖液中均質(zhì)2.4 min，得到最大的凝乳值(

5、274 U/mL)。實(shí)驗(yàn)值和預(yù)測值無顯著不同(P>0.05)。這些結(jié)果作用于優(yōu)化提取過程，并且與奶酪工業(yè)生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化植物凝乳劑有顯著相關(guān)性。
　　 (2)牛奶凝乳蛋白酶的純化。利用硫酸銨分離、離子交換和排阻作用色譜技術(shù)，姜的根莖34.9％復(fù)原。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定純化蛋白酶的分子質(zhì)量為36 kDa，pI值為4.3。最終該酶被純化約10.2倍。它是一種碳水化合物含量為3％的糖蛋白。這種純化酶在pH值5.5，溫度60℃表現(xiàn)出最大

6、的活性。其蛋白酶活性被碘代乙酰胺、E-64、PCMB、Hg2+和Cu2+強(qiáng)烈抑制。N-terminal序列分類研究表明，抑制酶是半胱氨酸蛋白酶的一種。孤立酶的斷裂能力高于αs-酪蛋白，β-酪蛋白和k-酪蛋白緊隨其后。從先前報(bào)導(dǎo)的姜蛋白酶可知，不同的純化酶，分子量、pI值、碳水化合物含量、N-terminal序列各不相同。這些結(jié)果表明，經(jīng)過純化的蛋白酶有潛在的能力作為皺胃酶的替代品應(yīng)用在乳品行業(yè)。
　　 (3)用植物來源的姜蛋白酶

7、和木瓜蛋白酶來研究對牛乳凝乳的影響。用比濁法來評估和比較用植源凝乳酶和小牛皺胃酶處理過的樣品的凝乳能力的不同。通過對合成奶酪脫水收縮量和感官評價(jià)的研究，發(fā)現(xiàn)小牛皺胃酶和姜蛋白酶牛奶的濁度都呈現(xiàn)三個(gè)不同發(fā)展階段的增長。姜蛋白酶和木瓜蛋白酶與小牛皺胃酶相比凝膠時(shí)間短，但是凝膠結(jié)束需要較長時(shí)間。這個(gè)從姜蛋白酶獲得的凝乳酶有較高產(chǎn)量。除了味道和苦澀，整體感覺，在凝乳酶中特性沒有表現(xiàn)顯著不同。
　　 (4)對凝乳劑的類型，包括小牛皺胃酶(

8、GP)或姜蛋白酶(CR)在奶酪形成的整個(gè)成熟過程中的影響進(jìn)行了評價(jià)，結(jié)果表明在奶酪的生產(chǎn)中使用小牛皺胃酶更利于蛋白質(zhì)的水解，在成熟60天后pH為4.6時(shí)，水溶性氮(WSN)、非蛋白氮(NPN)、氨基氮(NH3N)和氨基酸氮(AAN)的含量分別達(dá)到29.19％、9.86％、0.43％和0.59％，相比較使用姜蛋白酶生產(chǎn)的奶酪WSN、NPN、NH3N和AAN的量分別為18.23％、8.64％、0.46％和0.73％。使用小牛皺胃酶生產(chǎn)的奶酪

9、降解得到α-酪蛋白、β-酪蛋白和γ-酪蛋白的量均高于使用姜蛋白酶生產(chǎn)的奶酪。但是，在利用姜蛋白酶生產(chǎn)的奶酪成熟過程中，前體α-酪蛋白更易于降解，而且在整個(gè)的生產(chǎn)過程中疏水肽、親水肽以及二者的比例也明顯高于小牛皺胃酶生產(chǎn)的奶酪，這些結(jié)果將進(jìn)一步通過組成分分析(PCA)結(jié)果證實(shí)。
　　 (5)對用牛奶制成的Peshawari乳酪物化、微生物和感官特性進(jìn)行檢測，討論了姜蛋白酶和小牛皺胃酶對于乳酪品質(zhì)的影響。對于大多數(shù)的理化參數(shù)(脂肪、

10、蛋白質(zhì)、酸度、pH)，主要的微生物種群(總菌群，腸桿菌，乳酸菌，霉菌和酵母菌)進(jìn)行了研究，用不同的凝乳劑制成的乳酪呈現(xiàn)不顯著(P>0.05)差異。然而，用姜蛋白酶制成的奶酪和小牛皺胃酶相比，水分的顯著性呈現(xiàn)更低水平(P<0.05)，水溶性氮(SN)呈現(xiàn)高水平(P<0.05)。用姜蛋白酶制備的Peshawari奶酪，主要的感官屬性(外觀、質(zhì)感、氣味)均顯著提高(P<0.05)。重要的是，用姜蛋白酶制成的Peshawari奶酪沒有苦澀口感。