突觸蛋白Homerlb-c介導(dǎo)病理性疼痛的脊髓和皮層機(jī)制.pdf

1、疼痛是一種與組織損傷或潛在的損傷相關(guān)的，人類共有而個(gè)體差異很大的不愉快的主觀感覺和情感體驗(yàn)。疼痛提供機(jī)體受到威脅的警報(bào)信號(hào)，同時(shí)也給患者帶來痛苦。疼痛按時(shí)程可以分為急性疼痛和慢性疼痛。各種原因引起的慢性疼痛是導(dǎo)致勞動(dòng)力喪失的重要原因。在過去的幾十年中，從外周到中樞，對(duì)疼痛及其機(jī)制的研究取得了長足的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)了一些新的藥物作用靶點(diǎn)，并且開發(fā)了多種用于治療的藥物。但是，仍有大量病人時(shí)刻遭受著疼痛的折磨。
　　 前扣帶皮層(antei

2、or cingulate cortex，ACC)是邊緣系統(tǒng)的重要組成部分。ACC接受來自皮層下多種信息的傳入又可恒定地被外周傷害性刺激所激活，成為近年來疼痛研究的熱點(diǎn)區(qū)域。研究表明ACC不僅參與痛情緒的形成，還對(duì)疼痛感覺有調(diào)節(jié)作用。但是，外周傷害性刺激的持續(xù)傳入使ACC產(chǎn)生可塑性變化的分子機(jī)制，仍然知之甚少。
　　 研究認(rèn)為，中樞突觸功能的重塑是疼痛慢性化的重要機(jī)制。谷氨酸及其受體系統(tǒng)是介導(dǎo)傷害性信息傳遞和突觸重塑最重要的遞質(zhì)/

3、受體系統(tǒng)。突觸后致密物(postsynaptic density，PSD)是新近在谷氨酸能突觸后膜中發(fā)現(xiàn)的一種特殊結(jié)構(gòu)。PSD中的多種蛋白質(zhì)，能夠在突觸水平對(duì)谷氨酸受體進(jìn)行募集整合。Homer1b/c是PSD家族的一員，最近研究發(fā)現(xiàn)Homer1b/c與慢性疼痛的發(fā)生有關(guān)，但未有進(jìn)一步的研究報(bào)道。
　　 在慢性疼痛的研究中，完全弗氏佐劑(CFA)致大鼠慢性單關(guān)節(jié)炎模型(MA)和大鼠坐骨神經(jīng)慢性縮窄(chronic constric

4、tion injury，CCI)模型是兩種廣泛應(yīng)用的慢性痛模型，良好地模擬了人類慢性疼痛所表現(xiàn)的自發(fā)痛和刺激誘發(fā)痛等現(xiàn)象。本研究應(yīng)用動(dòng)物行為學(xué)、免疫組織化學(xué)、免疫沉淀和共沉淀、以及 Western-Blot等方法，在大鼠關(guān)節(jié)炎和坐骨神經(jīng)慢性縮窄模型上探討了突觸蛋白Homer1b/c在介導(dǎo)慢性疼痛發(fā)生發(fā)展中的可能作用及其機(jī)制，為研究慢性疼痛的發(fā)病機(jī)理及尋找有效的藥物靶位，提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 本實(shí)驗(yàn)分為三個(gè)部分：
　　 1

5、.在大鼠關(guān)節(jié)炎和坐骨神經(jīng)慢性縮窄模型上，應(yīng)用免疫組織化學(xué)、免疫沉淀和共沉淀等方法，檢測(cè)了脊髓背角以及前扣帶皮層(ACC)Homer1b/c的表達(dá)以及Homer1b/c與另一種突觸蛋白PSD-95的相互作用；
　　 2.應(yīng)用動(dòng)物疼痛指標(biāo)測(cè)定的方法，觀察了鞘內(nèi)注射Homer1b/c反義寡核苷酸對(duì)關(guān)節(jié)炎大鼠機(jī)械痛敏和熱痛敏的影響；
　　 3.應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色，在大鼠鞘內(nèi)注射Homer1b/c反義寡核苷酸后，觀察Homer1

6、b/c在脊髓背角Fos表達(dá)和cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)磷酸化中的作用。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：
　　 1.Homer1b/c在脊髓背角的表達(dá)特征
　　 與其他PSD蛋白的表達(dá)方式相似，Homer1b/c陽性細(xì)胞主要集中在脊髓背角淺層，在其他層次只看到很淺的免疫反應(yīng)陽性信號(hào)。在高倍鏡下觀察，Homer1b/c免疫反應(yīng)陽性物位于細(xì)胞膜，細(xì)胞呈圓形或橢圓形。免疫印跡結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Homer1b/c在大鼠脊髓背角有較高表

7、達(dá)，而脊髓腹角未檢測(cè)到信號(hào)。
　　 2.CFA致炎后，大鼠脊髓背角Homer1b/c的表達(dá)增加
　　 在CFA致炎后，大鼠脊髓背角Homer1b/c的表達(dá)呈單側(cè)性增加，大鼠脊髓背角Homer1b/c和PSD-95的共沉淀增加。而PSD-95的表達(dá)未見增加。相反，在炎癥的基礎(chǔ)上，對(duì)大鼠踝關(guān)節(jié)施加強(qiáng)制曲伸的急性刺激(retrival)后，PSD-95的表達(dá)減少。
　　 3.在CFA致炎后，大鼠ACC Homer1b/

8、c和PSD-95表達(dá)以及相互作用發(fā)生變化
　　 大鼠在CFA致炎后，對(duì)側(cè)ACC Homer1b/c和PSD-95表達(dá)增加；對(duì)側(cè) ACCHomer1b/c和PSD-95的共沉淀增加。該結(jié)果說明，在慢性疼痛狀態(tài)下，突觸后膜信號(hào)蛋白的相互作用加強(qiáng)。
　　 4.Homer1b/c參與神經(jīng)病理性疼痛的維持
　　 與先前研究結(jié)果一致，大鼠坐骨神經(jīng)慢性縮窄性損傷(CCI)后，損傷同側(cè)脊髓背角Homer1b/c表達(dá)增加；我們同時(shí)

9、發(fā)現(xiàn)，損傷對(duì)側(cè)ACC部位Homer1b/c和PSD-95的共沉淀增加。說明Homer1b/c同樣參與神經(jīng)病理性疼痛的維持。
　　 5.抑制Homer1b/c的表達(dá)對(duì)MA大鼠的痛敏反應(yīng)有減輕作用
　　 鞘內(nèi)應(yīng)用Homer1b/c反義寡核苷酸(10μg/10μl)，每日1次，連續(xù)4天，抑制大鼠脊髓背角Homer1b/c的表達(dá)的同時(shí)，減輕了炎癥痛大鼠對(duì)機(jī)械刺激和熱刺激的痛敏反應(yīng)。這種作用具有劑量依賴性。
　　 6.鞘內(nèi)

10、給予Homer1b/c反義寡核苷酸(ODN)對(duì)大鼠急性疼痛和運(yùn)動(dòng)功能無影響
　　 鞘內(nèi)給予錯(cuò)義寡核苷酸(10μg/10μl)或反義寡核苷酸(10μg/10μl)，連續(xù)4天，測(cè)定機(jī)械和熱刺激反應(yīng)閾值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與給藥前比較，反義寡核苷酸對(duì)正常動(dòng)物的機(jī)械縮足反射閾值(PWT)和熱縮足反射潛伏期(PWL)無顯著影響。對(duì)大鼠后肢的回縮，抓握功能以及整體動(dòng)物的翻正反射評(píng)分顯示，鞘內(nèi)給予Homer1b/c反義寡核苷酸(ODN)對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)功能

11、無影響。
　　 7.Homer1b/c介導(dǎo)初級(jí)中樞傷害性感受
　　 免疫組化結(jié)果顯示，鞘內(nèi)應(yīng)用Homer1b/c反義寡核苷酸，10μg/10μl，每日1次，連續(xù)4天，減輕了MA大鼠對(duì)傷害性刺激后，脊髓背角Fos蛋白的表達(dá)和CREB的磷酸化。該結(jié)果表明，Homer1b/c介導(dǎo)慢性疼痛時(shí)，初級(jí)中樞傷害性感受的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，以及下游的突觸功能的重塑。
　　 由以上結(jié)果得出如下結(jié)論：
　　 1.脊髓背角和前扣帶皮層H