多拉菌素產生菌基因組重排育種.pdf

1、多拉菌素是新一代大環(huán)內酯類抗生素,屬于阿維菌素第三代衍生物。其抗寄生蟲范圍廣泛,作用獨特,與其它抗寄生蟲藥物無交叉耐藥性,效果好,是目前具有開發(fā)潛力的獸用抗寄生蟲藥物。本論文通過基因組重排技術選育多拉菌素高產菌株,用響應面優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基,同時采用單因素方法優(yōu)化多拉菌素高產菌株發(fā)酵條件,為大規(guī)模生產提供可靠的工藝參數。
　　 首先對原始菌株進行分離復壯,采用傳統(tǒng)的紫外輻射和亞硝基胍誘變選育高產菌株做為基因組重排育種的出發(fā)菌株。同時

2、優(yōu)化了原生質體制備和融合條件。最佳方法為添加0.5％甘氨酸的YEME作為制備原生質體的菌絲培養(yǎng)基,培養(yǎng)20h后收集菌絲體用加入35顆玻璃珠的250ml搖瓶、250rpm振蕩45min打碎菌絲體,3mg/ml溶菌酶、30℃作用30min。原生質體制備率和再生率分別達到了88.9％、4.4％。最適融合條件為40％的PEG4000作用3min,融合率為8.3960。
　　 將誘變得來的高產菌株制備成原生質體,分別采用紫外照射200s、

3、60℃溫浴40min滅活后融合,用5μg/ml的鏈霉素抗性篩選第一輪基因組重排高產菌株。第一輪篩選得到的高產菌株作為第二輪基因組重排的出發(fā)菌株,如此重復進行4輪基因組重排。鏈霉素的抗性濃度分別是5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml。最后得到一株多拉菌素產量為547mg/l的遺傳穩(wěn)定菌株F4-120。其產量分別是原始菌株(103mg/l)和第一輪重排出發(fā)菌株最高產量(147mg/l)的531.07％、372.11％

4、。同時比較了原始菌株和重組菌株的發(fā)酵參數。
　　 采用響應面方法優(yōu)化了基因組重排菌株F4-120的發(fā)酵配方,得到玉米淀粉、蛋白胨和碳酸鈣為顯著影響因素,優(yōu)化后的濃度分別為118.9g/l、17.16g/l和10.18g/l。多拉菌素產量達到672mg/l,與優(yōu)化前相比提高了23％。
　　 另外本論文確定了多拉菌素產生菌的發(fā)酵溫度、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH、裝量、種子培養(yǎng)時間和移種量?？疾炝嗣舾卸?、前體添加時間和濃度及發(fā)酵過程中