新型轉(zhuǎn)氨酶Nec的克隆表達及其在西他列汀手性中間體合成中的應(yīng)用.pdf

1、西他列汀對糖尿病具有極好的療效。生物催化制備西他列汀是目前公認(rèn)的綠色環(huán)保高效的制備技術(shù)。本文設(shè)計了合成西他列汀的新路線，利用轉(zhuǎn)氨酶催化前體酮制備西他列汀合成的新型關(guān)鍵手性中間體，具有重要的研究意義。
　　本文首先建立了新型前體酮及手性中間體的液相分析方法。隨后運用基因探礦的方法，以ATA117氨基酸序列為模板，在基因數(shù)據(jù)庫中挖掘出五個可能具有催化活力的轉(zhuǎn)氨酶基因片段，將其分別構(gòu)建在pETDuet-1和pET-30a(+)的質(zhì)粒載體

2、上，并導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)中進行誘導(dǎo)表達。五個轉(zhuǎn)氨酶均成功實現(xiàn)可溶性表達，但酶活測定結(jié)果表明僅有pETDuet-1-Nec對底物前體酮具有微弱催化活力，發(fā)酵液酶活為0.08U/L，純酶比活0.007U/mg。
　　為了提高該酶針對西他列汀中間體前體酮的催化活力，本文對轉(zhuǎn)氨酶小口袋區(qū)域附近的三個位點V60、F113和A275進行定點飽和突變，共得到57個突變體，其中V60位點突變?yōu)門時酶活提高最為顯著，發(fā)酵液酶活達到0.1

3、04U/L，F(xiàn)113位點突變?yōu)镸時酶活提高最為顯著，發(fā)酵液酶活達到0.094U/L，而A275位點的突變體均無酶活。然后選取酶活相比原始酶有所提高的六個突變體V60T，V60M，F(xiàn)113S，F(xiàn)113Y，F(xiàn)113M，F(xiàn)113A進行組合突變，共得到8個突變體。其中V60T和F113M兩個位點的組合突變體轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)氨酶活力最高，發(fā)酵液酶活達到了0.112U/L，比活0.0095U/mg，比原始酶比活提高了36％。最后，我們對該突變酶進行了酶學(xué)性