基于表面應(yīng)力效應(yīng)的微懸臂梁免疫傳感技術(shù)研究.pdf

1、微懸臂梁作為最簡(jiǎn)單的MEMS器件，可提供與其它傳感器不同和互補(bǔ)的信息。與傳統(tǒng)的傳感器相比，顯示出非常低的檢測(cè)極限，并且無(wú)需生物標(biāo)記，能夠?qū)崟r(shí)的進(jìn)行檢測(cè)?；诳乖贵w特異性作用的免疫傳感技術(shù)保證了微梁免疫傳感器的高特異性。這些特點(diǎn)使其比肩甚至超過(guò)現(xiàn)有技術(shù)的能力，在藥物篩選、食品安全、環(huán)境監(jiān)測(cè)和醫(yī)療診斷等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。本文在課題組工作的基礎(chǔ)上，對(duì)表面應(yīng)力產(chǎn)生的機(jī)理和抗體固定方法等進(jìn)行了研究，取得主要成果如下:
　　 提出

2、了通過(guò)巰基化羊抗鼠IgG來(lái)固定抗體的方法，開(kāi)展了對(duì)人參皂苷Re的檢測(cè)。結(jié)果表明，該方法能夠?qū)⒖贵w固定到微梁表面，并且抗體的活性得到保持。檢測(cè)極限達(dá)到0.5 ng/mL。同時(shí)，利用該方法對(duì)紫杉醇進(jìn)行了檢測(cè)，通過(guò)巰基化羊抗鼠IgG固定抗體的微梁靈敏度要高于通過(guò)直接巰基化來(lái)固定抗體的微梁。
　　 第一次對(duì)小分子抗原與抗體結(jié)合導(dǎo)致微梁彎曲的機(jī)理進(jìn)行了解釋?？贵w在梁上的固定過(guò)程產(chǎn)生了一個(gè)壓應(yīng)力，而結(jié)合小分子抗原后產(chǎn)生一個(gè)張應(yīng)力。這種構(gòu)象的

3、變化表現(xiàn)為:抗體在結(jié)合抗原之前，F(xiàn)c段上用于補(bǔ)體激活的Clq結(jié)合位點(diǎn)被Fab所遮擋，結(jié)合抗原后，抗體的Fab繞鉸鏈區(qū)轉(zhuǎn)動(dòng)，從而暴露出Clq結(jié)合位點(diǎn)，這個(gè)變化導(dǎo)致同一抗體的兩個(gè)Fab的夾角變小，抗體由相對(duì)塌縮態(tài)變?yōu)橄鄬?duì)直立的狀態(tài)?？贵w的這種構(gòu)象的變化使得微梁表面的壓應(yīng)力得到一定的釋放，即產(chǎn)生了一個(gè)張應(yīng)力，驅(qū)動(dòng)微梁偏轉(zhuǎn)的能量來(lái)自抗體結(jié)合抗原前后構(gòu)象能的改變。
　　 研究了抗體的不同固定方法對(duì)抗體的一些性質(zhì)以及微梁靈敏度的影響。在微梁

4、上，對(duì)同一種抗體，采用三種不同的抗體固定方法:1）巰基化抗體方法;2）巰基化羊抗鼠IgG方法;3）硫醇自組裝將固定抗體。巰基化羊抗鼠IgG定向固定抗體雖然抗體的密度低，但是抗體的活性損失的少，方向性好，微梁擁有最高的靈敏度。定向固定的抗體，其抗原結(jié)合位點(diǎn)更好的暴露在溶液里，易于結(jié)合抗原。此外，定向固定的抗體方向一致，每個(gè)抗體結(jié)合抗原產(chǎn)生的應(yīng)力的方向也是一致的，會(huì)產(chǎn)生一個(gè)更大的合應(yīng)力。在另外兩種方法中，固定的抗體的方向是隨機(jī)的，產(chǎn)生的力的

5、方向也是隨機(jī)的，由這些應(yīng)力疊加而成的合力要遠(yuǎn)小于由同一方向的抗體所疊加產(chǎn)生的合力。
　　 采用不同碳鏈長(zhǎng)度的羧酸硫醇自組裝固定同一種抗體，研究了抗體與微梁之間連接層分子鏈的長(zhǎng)度對(duì)微梁靈敏度的影響，并建立了用于甘草酸非標(biāo)記檢測(cè)的微梁傳感器。結(jié)果表明，連接抗體與微梁的分子鏈的長(zhǎng)度對(duì)應(yīng)力的傳遞有著重要的影響，連接層分子鏈的長(zhǎng)度越短，微梁靈敏度越高。通過(guò)減小連接層碳鏈的長(zhǎng)度可以顯著提高基于力學(xué)效應(yīng)的傳感器的靈敏度。
　　 為進(jìn)一

6、步提高基于應(yīng)力效應(yīng)的微梁免疫傳感檢測(cè)靈敏度，提出了抗體片段的方法來(lái)修飾微梁。第一，以抗體的F(ab')2或Fab片段作為探針?lè)肿庸潭ǖ轿⒘荷稀(ab')2或Fab片段體積與質(zhì)量小，抗原結(jié)合位點(diǎn)的密度高?？乖Y(jié)合位點(diǎn)到梁表面距離短，應(yīng)力的傳遞效率更高。第二，利用巰基乙胺還原抗體得到帶有兩個(gè)巰基(-SH)的半抗體片段，再通過(guò)自帶的巰基將其定向固定到微梁表面。結(jié)果表明，半抗體片段固定方法用于人參皂苷Re的檢測(cè)極限達(dá)到甚至低于0.02ng/m

7、L。該方法操作簡(jiǎn)單;固定的方向性好，易于與抗原結(jié)合;固定的抗原結(jié)合位點(diǎn)密度高，穩(wěn)定性好;雙巰基固定的剛性大，有益于反應(yīng)的作用力傳遞到梁上;抗原結(jié)合位點(diǎn)到微梁表面的距離短，應(yīng)力的傳遞效率更高。
　　 本文首次對(duì)小分子抗原結(jié)合抗體產(chǎn)生表面應(yīng)力的機(jī)理進(jìn)行了解釋。在對(duì)這種機(jī)理理解的基礎(chǔ)上對(duì)抗體的固定方法進(jìn)行了研究。定向固定的抗體除了易于結(jié)合抗原外，結(jié)合抗原后構(gòu)象改變引起的應(yīng)力（或應(yīng)變）方向也是一樣的，從而產(chǎn)生一個(gè)更大的合力。碳鏈長(zhǎng)度對(duì)應(yīng)