缺血再灌注損傷與細(xì)胞凋亡在早期壓瘡中作用的初步探討.pdf

1、壓瘡(PressureUlcer，PU)是臨床常見的并發(fā)癥之一，其形成是多因素參與的復(fù)雜過程。缺血再灌注損傷機(jī)制被認(rèn)為是壓瘡發(fā)生的重要機(jī)制，該機(jī)制在心、腦等組織器官的研究中較為深入，可為壓瘡研究借鑒。本研究試圖通過早期壓瘡動(dòng)物模型初步探討缺血再灌注損傷相關(guān)機(jī)制與細(xì)胞凋亡在早期壓瘡形成中的作用。全文主要包括以下兩部分：第一部分，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)建立早期壓瘡動(dòng)物模型；第二部分，在成功建模的基礎(chǔ)上探討缺血再灌注損傷引起的代謝變化和細(xì)胞凋亡在早期壓瘡

2、形成中的作用。
　　 目的：(1)通過文獻(xiàn)研究結(jié)合壓瘡發(fā)生背景建立符合實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡脑缙趬函弰?dòng)物模型，并摸索該模型的最適壓強(qiáng)值：(2)通過檢測受壓肌組織中MPO、MDA含量，三種ATP酶活性，蘭尼定受體-1mRNA(RyR1mRNA)及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax表達(dá)的變化.探討缺血再灌注損傷引起的代謝變化與細(xì)胞凋亡在早期壓瘡形成中的作用及其關(guān)系的研究，以期為早期壓瘡的干預(yù)研究提供可參考的分子靶點(diǎn)。
　　 方法：第一部分：

3、48只SD雄性大鼠隨機(jī)均分為6組，每組各8只，均行10％水合氯醛麻醉后對照組不予以壓力；實(shí)驗(yàn)組A-E組采用特制壓力裝置對大鼠股薄肌處進(jìn)行施壓。A組予以100mmHg(13.73kPa)壓強(qiáng)；B組予以150mmHg(19.97kPa)壓強(qiáng)；C組予以170mmHg(22.47kPa)壓強(qiáng)；D組予以220mmHg(28.71kPa)壓強(qiáng)；E組予以270mmHg(34.96kPa)壓強(qiáng)。五組均經(jīng)歷同等時(shí)間的缺血-再灌注循環(huán)(即3個(gè)循環(huán)的I/R，

4、I=缺血2h,R=再灌注0.5h)。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，肉眼觀察大鼠受壓部位皮膚顏色和形態(tài)變化，采集受壓組織中心標(biāo)本后所有大鼠給予安樂死。通過肉眼觀察結(jié)果，光鏡下皮膚、肌肉組織病理學(xué)變化分析，并用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測受壓肌組織中髓過氧化物酶(MPO)含量的變化以檢驗(yàn)?zāi)Ｐ筒⒄覍ぴ撃Ｐ偷淖钸m壓強(qiáng)值。
　　 第二部分：在第一部分實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，將36只SD大鼠隨機(jī)均分為三組各12只，均行10％水合氯醛麻醉后，利用最適壓強(qiáng)值170mmH

5、g(22.47kPa)，對照組不予以壓力；實(shí)驗(yàn)A、B兩組給予大鼠股薄肌處同一壓強(qiáng)170mmHg但不同壓力循環(huán)施壓。A組予以3個(gè)缺血-再灌注循環(huán)(3I/R,I=缺血2.0h,R=再灌注0.5h)，B組給予5個(gè)I/R。各組動(dòng)物于相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，采集受壓組織中心標(biāo)本后所有大鼠給予安樂死。通過常規(guī)石蠟切片、HE染色、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、比色法、real-timeRT-PCR、SP法免疫組織化學(xué)染色、TUNEL技術(shù)分別檢測各組肌組織中

6、髓過氧化物酶(MPO)和丙二醛(MDA)的含量，三種ATP酶的活性，蘭尼定受體-1mRNA(RyR1mRNA)的表達(dá)，凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)及細(xì)胞凋亡指數(shù)，并分析各指標(biāo)之間的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：第一部分(1)肉眼觀察結(jié)合光鏡觀察結(jié)果：A組與對照組相比，皮膚肉眼觀察并無差別，但光鏡下皮下結(jié)締組織和肌組織有輕度炎性反應(yīng)；隨著壓強(qiáng)的增加，C組皮膚在經(jīng)歷170mmHg壓力后，肉眼觀察局部出現(xiàn)持續(xù)非蒼白性發(fā)紅現(xiàn)象，同時(shí)其皮

7、下結(jié)締組織和肌組織炎性反應(yīng)較重，與臨床典型的Ⅰ期壓瘡相似。(2)MPO含量檢測結(jié)果：各實(shí)驗(yàn)組與對照組MPO含量分別兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；各組分別與其他組進(jìn)行MPO含量比較，除了B、C組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，其余各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。第二部分(1)MPO和MDA含量檢測結(jié)果：實(shí)驗(yàn)A、B兩組與對照組比較，二者含量顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；隨著壓力循環(huán)增加，B組含

8、量較A組顯著增加，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。(2)三種ATP酶活性檢測結(jié)果：隨著受壓循環(huán)的增加，三組總ATP酶活性、Ca2+Mg2+-ATP酶活性、Na+K+-ATP酶活性均呈下降趨勢，其組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。(3)RyR1mRNA表達(dá)：隨著受壓循環(huán)的增加，實(shí)驗(yàn)A組RyR1mRNA的表達(dá)較對照組下調(diào)，實(shí)驗(yàn)B組與A組比較，表達(dá)下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。(4)凋亡指數(shù)（AI）：總的來說，實(shí)驗(yàn)組A

9、I較對照組顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；且隨著壓力循環(huán)的增加，B組較A組AI顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。(5)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)：Bax蛋白在對照組幾乎不表達(dá)，隨著壓力循環(huán)增加，其表達(dá)顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。Bcl-2蛋白在對照組少量表達(dá)，隨著受壓循環(huán)增加，A組較對照組表達(dá)明顯增多，而B組其表達(dá)顯著減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。(6)Bcl-2/Bax比值變化結(jié)

10、果：對照組中Bcl-2/Bax比值遠(yuǎn)大于A組和B組，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；隨著壓力循環(huán)增加，比值呈下降趨勢，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。(7)相關(guān)分析結(jié)果：MPO與MDA含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P＜0.01)，相關(guān)系數(shù)r為0.895;總ATP酶活力與MDA含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r為-0.918(P＜0.01):總ATP酶活力與RyR1mRNA表達(dá)呈顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r為0.713(P＜0.01);Ry

11、R1mRNA表達(dá)與MDA含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r為-0.702(P＜0.01)。Bcl-2/Bax比值與AI及Bax分別呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(P＜0.01)，相關(guān)系數(shù)r分別為-0.640、-0.621;MDA含量與細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P＜0.01)，相關(guān)系數(shù)r為0.916:MPO含量與AI呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P＜0.01)，相關(guān)系數(shù)r為0.922。
　　 結(jié)論：(1)早期壓瘡動(dòng)物模型建立成功；170mmHg