新型VEGF-SF-CS支架材料表征及體內(nèi)外生物相容性研究.pdf

1、目的：
　　異體骨移植因?yàn)榕懦夥磻?yīng)、病毒因素和相對(duì)較高的吸收率而在骨科及頜面整形外科的應(yīng)用受到了明顯的限制。科學(xué)家及醫(yī)生們致力于尋找有廣泛應(yīng)用前景的傳統(tǒng)骨移植替代品，骨組織工程技術(shù)的出現(xiàn)，極大地刺激了人工骨的研制。骨組織工程目的是骨缺損修復(fù)及重建。骨組織工程最新的研究熱點(diǎn)是創(chuàng)造出全新的組織相容性支架材料，而這種支架將做為骨組織再生模版，用于支持負(fù)載，細(xì)胞附著和組織缺陷的修復(fù)。支架材料應(yīng)該具備足夠的機(jī)械性能，以匹配和支持的骨組織本身

2、所存在的生理負(fù)荷，從而在組織愈合過程中有利的方式轉(zhuǎn)移了支持組織的負(fù)載。
　　相比于其他生物材料，絲素(SF)和殼聚糖(CS)是兩種杰出的生物聚合物，目前是骨組織工程支架材料研究的熱點(diǎn)。純SF支架可支持多種類型的細(xì)胞。純SF支架呈片狀結(jié)構(gòu)，具有極小的孔隙(直徑約20μm)，孔隙在SF的片狀結(jié)構(gòu)之間相互關(guān)聯(lián)。然而，純SF支架在于燥狀態(tài)下很脆易碎，難于處理。CS由于其較小的炎性毒性反應(yīng)和良好的生物降解性能以及優(yōu)良的骨傳導(dǎo)耦合性，因此在做

3、為生物支架材料的候選材料中正日益受到人們的重視。然而，由于CS力學(xué)性能較差以及其高溶脹能力導(dǎo)致其在做為組織工程化骨的過程中極易變形。研究人員將CS與其他生物大分子聚合物共混，以謀求建立一個(gè)功能更加完善的復(fù)合性支架來改善CS的這些不足，增強(qiáng)了其機(jī)械性能并保持其成骨性能。CS通過與SF共混形成SF-CS支架能夠改善SF結(jié)構(gòu)并能促進(jìn)骨的早期愈合。SF-CS復(fù)合支架材料目前已經(jīng)在許多領(lǐng)域得到應(yīng)用，例如醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、組織工程和基礎(chǔ)科學(xué)。
　　

4、生長(zhǎng)因子是可溶性蛋白，具有刺激細(xì)胞增殖分化的功能，可用于幫助細(xì)胞的遷徙，增加細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生。生長(zhǎng)因子利用方式一般是將其吸收入支架材料中以維持其蛋白穩(wěn)定性及控制其在支架內(nèi)的釋放。生長(zhǎng)因子的添加策略及方式在骨再生應(yīng)用方面顯示了其重要的功能及意義。VEGF可產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)，因而在骨組織愈合過程中發(fā)揮極其重要作用。先前的研究結(jié)果論證了VEGF是骨血管化的關(guān)鍵誘導(dǎo)因素，并且證實(shí)了VEGF能夠影響參與骨代謝的各種類型的細(xì)胞。科學(xué)家證實(shí)VEGF對(duì)

5、于BMSCs的增殖、遷移和存活等有著直接作用。
　　以骨修復(fù)為目的，為細(xì)胞提供生長(zhǎng)因子釋放的最佳方案仍然是一個(gè)難題。我們首次將VEGF在SF-CS制作過程中添加進(jìn)SF-CS。在以往的研究中，生長(zhǎng)因子被添加到培養(yǎng)基中，然后將含有生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)液吸收進(jìn)復(fù)合支架以促進(jìn)生長(zhǎng)因子在體內(nèi)外的釋放。這種方法有著明顯的缺點(diǎn)，即復(fù)合支架中生長(zhǎng)因子的劑量和空間分布是不可控的，而且釋放只發(fā)生在細(xì)胞培養(yǎng)的早期，原因是由于生長(zhǎng)因子只存在于支架的表面并未吸收

6、入支架內(nèi)部，或由于在早期釋放量過大而后期無足夠的含量。為了解決這一難題，本研究組提出一種全新的生長(zhǎng)因子添加策略，即在SF-CS生物支架的制備階段直接添加VEGF，而非在支架的制備完成之后才將VEGF添加進(jìn)生物支架，從而開發(fā)出一種全新的VEGF-SF-CS復(fù)合支架。首先確保VEGF在SF-CS支架中能到達(dá)到治療水平的釋放。VEGF-SF-CS支架對(duì)成骨細(xì)胞及BMSCs的形態(tài)、功能、分化及增殖的影響目前還沒有研究，本實(shí)驗(yàn)利用體內(nèi)外相關(guān)實(shí)驗(yàn)試

7、圖填補(bǔ)這一空白。本研究評(píng)估了VEGF-SF-CS做為一種骨組織工程支架的可行性。本實(shí)驗(yàn)首次報(bào)告了利用VEGF-SF-CS修復(fù)兔下頜骨缺損模型。
　　方法：
　　1、提取、傳代及擴(kuò)增人成骨細(xì)胞hFOB1.19及形態(tài)學(xué)觀察。
　　2、制備SF-CS，并進(jìn)行檢測(cè)表征。
　　3、SF-CS支架復(fù)合多孔支架降解性進(jìn)行分析。
　　4、hFOB1.19和含VEGF的SF-CS支架復(fù)合培養(yǎng)。研究并比較含VEGF的絲素-殼聚

8、糖支架及SF-CS三維多孔支架中hFOB1.19增殖、粘附、分化及成骨性能。
　　5、兔BMSCs的提取、培養(yǎng)及傳代并進(jìn)行細(xì)胞觀察、描繪生長(zhǎng)曲線、成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)、堿性磷酸酶細(xì)胞染色、并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行礦化結(jié)節(jié)染色。
　　6、在含VEGF的SF-CS支架及SF-CS支架三維多孔支架中接種兔BMSCs，掃描電鏡觀察并比較細(xì)胞在兩種支架內(nèi)生長(zhǎng)情況。
　　7、兔下頜骨缺損模型的制備，分別植入VEGF-SF-CS支架及SF-CS支架三

9、維多孔支架并設(shè)立對(duì)照組。
　　8、對(duì)兔下頜骨缺損模型進(jìn)行成骨性檢測(cè)。
　　9、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　1.SF/CS按質(zhì)量配比5∶5更符合要求:平均孔徑（220土91）μm，孔隙率為（89.5±7.5）％;吸水率為（282±4）％，溶脹率（24.5±0.5）％;壓縮強(qiáng)度（0.67±0.15）MPa;壓縮模量(9.08±2.73) MPa。
　　2.在VEGF-SF-CS及SF-CS中，黏附率隨時(shí)間的延

10、長(zhǎng)而上升。掃面電鏡觀察顯示成骨細(xì)胞生長(zhǎng)正常，在支架表面及內(nèi)部均可見。CCK-8及ALP檢測(cè)證明VEGF對(duì)人成骨細(xì)胞hFOB1.19在SF-CS支架內(nèi)的生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用。
　　3.通過12周的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，樣品組織學(xué)檢查及兔下頜骨三維CT顯示VEGF-SF-CS支架表現(xiàn)出更好的生物相容性及成骨性。此外，在SF-CS支架中添加VEGF后，將復(fù)合支架植入兔下頜骨8周后，可以看到復(fù)合支架能明顯促進(jìn)新生骨的形成。
　　結(jié)論：