古井窖泥微生物群落綱層級(jí)定量識(shí)別的引物設(shè)計(jì)和應(yīng)用.pdf

1、古井窖泥中含有豐富的微生物群落，在釀制獨(dú)特風(fēng)味白酒的過(guò)程中起到了關(guān)鍵作用，而對(duì)窖泥中微生物群落結(jié)構(gòu)的解析，目前既有的研究尚欠深入。本課題借助于古井窖泥16S rRNA基因序列分析其微生物群落多樣性的特征，搜索分類層級(jí)上的SNP(Single Nucleotide Polymorphisms)位點(diǎn)，判斷設(shè)計(jì)引物所在的最佳分類層級(jí)，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)綱特異性引物，實(shí)現(xiàn)在綱分類層級(jí)上對(duì)古井窖泥中微生物群落結(jié)構(gòu)的定量識(shí)別。
　　微生物群落的多

2、樣性與環(huán)境因素息息相關(guān)，不同環(huán)境下的微生物種群結(jié)構(gòu)可能差異很大。古井窖泥中的微生物的種類和白酒的風(fēng)味密切相關(guān)，Clostridia綱作為主要的產(chǎn)香菌在窖泥中的含量最高，進(jìn)化樹分析表明該綱16S序列復(fù)雜性最高，而且與其他的幾個(gè)綱交織在一起在進(jìn)化樹上無(wú)法分開，可能是與其它綱微生物共生的緣故。對(duì)290條高質(zhì)量16S序列的多樣性指數(shù)分析表明這些序列包含的信息足夠反映出窖泥中真實(shí)的情況。
　　通過(guò)對(duì)古井窖泥高質(zhì)量16S序列進(jìn)行Mafft多序

3、列比對(duì)分析，選擇分類層級(jí)特異性的SNP位點(diǎn)，繼而應(yīng)用SAP（Simple Allele-discriminating PCR）引物設(shè)計(jì)原理和一般的引物設(shè)計(jì)規(guī)則，共設(shè)計(jì)出10對(duì)綱特異性引物，檢測(cè)并篩選具有良好特異性的引物。對(duì)特異性較差的綱引物進(jìn)行調(diào)整實(shí)驗(yàn)條件或設(shè)計(jì)新引物，最終確定了8對(duì)特異性高的綱引物，同時(shí)也確定了各個(gè)綱引物具體的PCR及qPCR反應(yīng)條件。
　　通過(guò)不同混合比例的模板對(duì)8對(duì)特異性引物進(jìn)一步檢測(cè)和篩選，目的是篩選出能用

4、于準(zhǔn)確定量的綱特異性引物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了Betaproteobacteria綱外，其余的7對(duì)引物均對(duì)不同濃度的模板具有高度的靈敏性。隨后將其分別用于窖泥宏基因組的定量分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明除了Alphaproteobacteria綱之外的6對(duì)綱特異性引物具有準(zhǔn)確的定量性質(zhì)，可以得到各個(gè)的綱組成和含量等精確信息。最終確定的6對(duì)綱特異性引物分別針對(duì)Actinobacteria、Gammaproteobacteria、Bacteroidia、Mol