基于表面增強拉曼光譜法的新型高靈敏度核酸傳感器.pdf

1、本文構(gòu)建了幾種新型的核酸放大策略，并與高靈敏度的表面增強拉曼散射分析方法結(jié)合，構(gòu)建了三種新型的SERS放大檢測方法:基于DNA滾環(huán)聚合和滾環(huán)轉(zhuǎn)錄的循環(huán)放大方法、基于DNA自組裝引發(fā)的非線性雜交的SERS放大方法、基于熵驅(qū)動引發(fā)的轉(zhuǎn)錄和非線性樹枝狀雜交聯(lián)合的DNA循環(huán)放大方法，實現(xiàn)了對miRNA的高靈敏度、高選擇性檢測。主要內(nèi)容包括以下幾個方面:
　　1、構(gòu)建滾環(huán)聚合和滾環(huán)轉(zhuǎn)錄聯(lián)用的復(fù)合核酸反應(yīng)放大機制，表面增強拉曼的方法檢測miR

2、NA，實現(xiàn)了miRNA的高靈敏度、高選擇性、快速檢測。滾環(huán)聚合和滾環(huán)轉(zhuǎn)錄各提供一個層次的放大，設(shè)計了一個單鏈環(huán)狀DNA結(jié)構(gòu)作為探針，該探針包括以下功能片段:“引發(fā)位點”:特異性識別目標(biāo)miRNA;“引物結(jié)合位點”:動態(tài)的與引物互補的片段，在初始階段是被“鎖住”的，與“識別位點”互補配對;“識別位點”:后面序列的打開會引起前面序列的打開;“孔雀石綠適體模板”:與孔雀石綠的RNA適體互補的DNA片段;“剪切位點”:切克內(nèi)切酶剪切序列的單鏈，

3、與其互補的序列結(jié)合后，形成功能化的雙鏈剪切位點;“啟動位點”:功能化雙鏈T7啟動子的單鏈。靶標(biāo)miRNA由“引發(fā)位點”特異性識別，并利用環(huán)形單鏈探針的各功能片段，引發(fā)滾環(huán)聚合階段、中間階段、滾環(huán)轉(zhuǎn)錄階段一系列放大反應(yīng)依次發(fā)生，產(chǎn)生實現(xiàn)了靶miRNA的循環(huán)利用和滾環(huán)聚合和滾環(huán)轉(zhuǎn)錄的聯(lián)合放大，檢測限可達(dá)10-16 M。中間階段被證明是產(chǎn)生低檢測限所必需的。該方法具備區(qū)分靶標(biāo)miRNA序列以及序列相近的其他miRNA序列的選擇性，并可用于檢測

4、不同的腫瘤細(xì)胞或其他的腫瘤標(biāo)志物。
　　2、將基于核酸引發(fā)的非線性的雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的放大策略與表面增強拉曼檢測方法聯(lián)用，以Trigger DNA引發(fā)，使預(yù)先制備的兩種雙鏈結(jié)構(gòu)DNA組裝單元連續(xù)自發(fā)地組裝成帶有羅丹明信號的樹枝狀結(jié)構(gòu)，再通過金納米粒子的增強，實現(xiàn)了對羅丹明的拉曼散射信號的放大。本方法的原料僅為DNA和雜交緩沖液，無需任何酶的參與，相比于滾環(huán)聚合和滾環(huán)轉(zhuǎn)錄聯(lián)合SERS信號放大系統(tǒng)，其反應(yīng)操作更加簡單、快捷，且其本身具有較

5、高的靈敏度。
　　3、本章在第3章開發(fā)的新型樹枝狀雜交放大表面增強拉曼產(chǎn)生信號的檢測方法的基礎(chǔ)上，進一步結(jié)合基于熵驅(qū)動的靶循環(huán)放大方法，構(gòu)建了復(fù)合放大檢測體系。該方法利用miRNA引發(fā)制備好的探針的熵驅(qū)動的雜交，再通過聚合產(chǎn)生RNA轉(zhuǎn)錄的DNA模板鏈，結(jié)合RNA聚合酶、NTPs及其緩沖液，產(chǎn)生引發(fā)樹枝狀雜交的引發(fā)鏈，引發(fā)羅丹明修飾的DNA的鏈的自發(fā)雜交組裝，再通過雜交附著納米金顆粒，米實現(xiàn)羅丹明的拉曼信號的放大，力圖實現(xiàn)靶miRN