BH3 mimetics分子優(yōu)化的量熱學(xué)研究.pdf

1、B-cell lymphoma2(Bcl-2)家族蛋白是細(xì)胞凋亡的主要調(diào)控者，它包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白兩類，這兩種功能截然相反的蛋白通過共有的Bcl-2 homology domain3(BH3)進(jìn)行相互作用決定細(xì)胞的生與死。因此，許多研究組致力于靶向Bcl-2家族蛋白BH3溝槽的小分子抑制劑的研究，這些小分子抑制劑也稱為BH3 mimetics，目前還沒有BH3mimetics被批準(zhǔn)上市。處于臨床期的ABT-737由于不能拮抗my

2、eloid cell leukemiasequence1(Mcl-1)蛋白而對許多癌癥產(chǎn)生耐藥。因此，BH3 mimetics作為抗癌藥的研究依然面臨著很多挑戰(zhàn)。
　　眾所周知，藥物分子與靶標(biāo)蛋白的結(jié)合過程必然涉及到熱量的變化。在熱力學(xué)水平，結(jié)合常數(shù)（Ka）、由吉布斯自由能(△G)、焓（△H)和熵（△S)是描述小分子與靶標(biāo)蛋白相互作用的參數(shù)，等溫滴定量熱實(shí)驗(yàn)（isothermal titration calorimetry，ITC

3、）是唯一一種將結(jié)合能拆分成焓變和熵變，并且能測得上述所有參數(shù)的一種方法。焓變值可以證實(shí)氫鍵的形成，在分子優(yōu)化過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測焓值、熵值的變化可以用于指導(dǎo)小分子抑制劑的優(yōu)化。因此，將量熱學(xué)手段運(yùn)用于小分子抑制劑的優(yōu)化不失為一種有效的方法。
　　本文通過BH3 mimetics和Mcl-1蛋白的等溫滴定量熱實(shí)驗(yàn)，分析其結(jié)合模式，并用于指導(dǎo)其他BH3 mimetics的優(yōu)化。
　　首先，我們構(gòu)建了人源Mcl-1蛋白的重組質(zhì)粒，通過條

4、件的摸索與優(yōu)化獲得了純度為95％的Mcl-1蛋白。通過圓二色光譜分析證明純化所得蛋白的二級結(jié)構(gòu)以a螺旋為主，15N-1H異核化學(xué)位移相關(guān)譜(1H detected heteronuclear single quantum coherence，HSQC)表明蛋白質(zhì)各氨基酸的共振峰分散均勻，具有穩(wěn)定的、折疊良好的結(jié)構(gòu)，熒光偏振實(shí)驗(yàn)證明Mcl-1蛋白的活性正常，這一系列結(jié)果證明純化所得蛋白滿足后續(xù)檢測的要求。
　　接下來，我們對本課題組

5、合成的小分子8與Mcl-1蛋白進(jìn)行核磁滴定實(shí)驗(yàn)證實(shí)了化合物8結(jié)合在Mcl-1的BH3溝槽，然后用等溫滴定量熱的方法分別測得化合物8與Mcl-1和Mcl-1(R263A)作用的量熱學(xué)數(shù)據(jù)，通過分析兩次焓值證實(shí)了化合物8與Mcl-1 BH3溝槽的R263形成了氫鍵。
　　基于上述研究，我們又用等溫滴定量熱實(shí)驗(yàn)監(jiān)測一系列BH3 mimetics1-6與Mcl-1蛋白的作用，并對量熱學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行了測定與分析?；衔?與1相比，焓變增加值4.