藍(lán)鯊Ⅱ型膠原蛋白生物化學(xué)特性和免疫耐受特性的研究.pdf

1、海洋生物Ⅱ型膠原蛋白(typeⅡcollagen,CⅡ)是海洋生物軟骨組織的主要構(gòu)成蛋白,其與皮膚或骨骼中存在的Ⅰ型膠原蛋白在氨基酸構(gòu)成以及空間結(jié)構(gòu)上有明顯的不同,并且結(jié)合有Ⅰ型膠原蛋白不存在的構(gòu)成糖。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種病因尚未明了的慢性全身性炎癥性疾病,以慢性、對(duì)稱性、多滑膜關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)外病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn),屬于自身免疫性疾病。它以關(guān)節(jié)和滑膜的炎癥及軟骨和骨的進(jìn)行性破壞為特征,致殘率

2、高。已經(jīng)有資料顯示,雞或牛的CⅡ通過(guò)口服免疫耐受作用達(dá)到治療RA的作用。為此,我們深入探討了海洋生物來(lái)源的CⅡ在治療RA方面的特性,豐富了CⅡ在其應(yīng)用領(lǐng)域的功能作用,填補(bǔ)了海洋生物CⅡ的研究空白。
　　第一章從口服免疫耐受對(duì) RA的治療作用和 CⅡ在大鼠RA模型中的自我免疫作用兩個(gè)方面簡(jiǎn)要介紹了CⅡ在RA治療中的應(yīng)用。
　　第二章介紹了CⅡ的分離純化,分離CⅡ的實(shí)驗(yàn)材料是新鮮的藍(lán)鯊(Prionace glauca)軟骨,采用

3、胃蛋白限制性酶解分離法。SDS-PAGE上顯示藍(lán)鯊Ⅱ型膠原蛋白(SCⅡ)是由分子量為130 kDa的α1鏈構(gòu)成,另外,圖譜上無(wú)其他雜帶,說(shuō)明提取得到的SCⅡ達(dá)到了電泳純。對(duì)SCⅡ常見(jiàn)氨基酸和羥脯氨酸的比例和含量進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明 SCⅡ的甘氨酸殘基占氨基酸殘基總數(shù)的30％以上,并且富含丙氨酸殘基和脯氨酸殘基,分別占氨基酸殘基總量的10.4%和8.8%,由制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線推算出SCⅡ羥脯氨酸的含量為7.09%,另外,氨基酸分析過(guò)程中并無(wú)酪

4、氨酸和色氨酸檢出。
　　第三章深入分析了SCⅡ一系列的生物化學(xué)特性。分別通過(guò)差示掃描量熱法、圓二色譜法、紫外掃描法和紅外光譜法分析了SCⅡ的熱變性溫度、二級(jí)結(jié)構(gòu)特征、紫外吸收特性和紅外光譜特征。差示掃描量熱儀的檢測(cè)結(jié)果顯示SCⅡ的熱變性溫度為40.5℃,并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了鹽濃度和氫離子濃度對(duì)其熱變性溫度有著重要的影響。采用圓二色光譜研究SCⅡ的二級(jí)結(jié)構(gòu)特征,計(jì)算出了SCⅡ二級(jí)結(jié)構(gòu)的組成和比例,并深入探討了氫離子濃度和保溫時(shí)間對(duì)SCⅡ

5、二級(jí)結(jié)構(gòu)組成和比例的影響,發(fā)現(xiàn)這二者對(duì) SCⅡ的二級(jí)結(jié)構(gòu)有著極大的影響。紫外掃描法顯示,SCⅡ在260nm處有最大的紫外吸收。紅外光譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SCⅡ最主要的吸收帶在酰胺帶處,包括酰胺Ⅰ(1649-1658cm-1)、酰胺Ⅱ(1551-1557cm-1)、酰胺Ⅲ(1239-1245cm-1)、酰胺A(3407-3425cm-1)和酰胺B(2932-2961cm-1)。
　　第四章介紹了在堿性條件下將FITC標(biāo)記到SCⅡ上,獲得了

6、FITC-SCⅡ復(fù)合物,并通過(guò)SDS-PAGE對(duì)標(biāo)記結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。熒光及白光成像相結(jié)果相對(duì)比后發(fā)現(xiàn),FITC成功的標(biāo)記到了SCⅡ上,且熒光成像結(jié)果表明復(fù)合物熒光強(qiáng)度較強(qiáng),說(shuō)明FITC-SCⅡ復(fù)合物結(jié)合牢固,性質(zhì)穩(wěn)定。
　　第五章介紹的是 SCⅡ?qū)?CD8+T細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的影響。我們將結(jié)合成功的FITC-SCⅡ復(fù)合物用細(xì)胞培養(yǎng)液配制成11.1μg/mL,5.56μg/mL,3.33μg/mL和1.11μg/mL四個(gè)濃度梯度,與CD8

7、+T細(xì)胞在37℃,5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,培養(yǎng)結(jié)束后于熒光倒置顯微鏡下拍照。結(jié)果顯示,FITC-SCⅡ復(fù)合物與CD8+T細(xì)胞表面的特異性受體發(fā)生了特異性結(jié)合。隨后我們又探討了SCⅡ與CD8+T細(xì)胞表面的受體發(fā)生特異性結(jié)合后對(duì)細(xì)胞活性和功能的影響,發(fā)現(xiàn)CⅡ作為一種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)了CD8+T細(xì)胞的生長(zhǎng),但它同時(shí)也可令CD8+T細(xì)胞發(fā)生僵化作用,激活CD8+T抗原受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)下游通路,產(chǎn)生較多的細(xì)胞凋亡因子Fas。
　　第六章通

8、過(guò)建立動(dòng)物模型來(lái)驗(yàn)證口服CⅡ產(chǎn)生免疫耐受治療RA的效果,并探討其治療機(jī)理。首先,我們按照1mg/Kg/d和3mg/Kg/d的劑量對(duì)大鼠灌服CⅡ,并設(shè)置空白組、陰性對(duì)照組(灌服TWP)和陽(yáng)性對(duì)照組(灌服乙酸),連續(xù)灌胃15天后,用0.1ml完全弗氏佐劑(CFA)于實(shí)驗(yàn)組右后足墊處注射致炎,在隨后的30天內(nèi)通過(guò)大鼠的臨床癥狀表現(xiàn)來(lái)評(píng)價(jià)關(guān)節(jié)炎指標(biāo),最后將大鼠處死取靜脈血, ELISA法檢測(cè)其血清中抗CⅡ抗體、IL-10、IFN-γ和TNF-α