玉米種子純度快速分子檢測技術研究.pdf

1、種子銷售過程中經(jīng)常出現(xiàn)侵權行為或違規(guī)經(jīng)營行為，種子質(zhì)量越來越受到重視，其中玉米種子純度倍受關注。種子純度檢測方法有很多，傳統(tǒng)的檢測方法發(fā)揮了重要作用，但是由于眾多不利因素，這些方法難以滿足快速、準確的種子純度檢測需求。分子檢測技術的準確性高，但是目前的檢測時間較長。本研究以SSR標記技術為基礎，通過DNA快速提取方法和通用多重PCR技術的研發(fā)，建立了一種玉米種子純度快速分子檢測技術。該技術在玉米品種保護、純度和真實性檢測方面具有重要價值

2、，對保證玉米種子質(zhì)量安全具有重要意義。主要研究結果如下:
　　 1.通過DNA提取方法的研究，建立了一種基于PCR的玉米半粒種子DNA快速提取方法。研究了提取液濃度、提取液體積、提取時間對DNA完整性和PCR產(chǎn)物的影響，DNA模板量和不同公司的Mix對PCR產(chǎn)物的影響，得出DNA快速提取方法的參數(shù)范圍。將玉米種子沿胚縱切，取一半（必須含有胚）放入1.5 mL離心管中，加入200μL-1000μL提取液(0.03 M-0.2 M

3、KOH或NaOH溶液)，提取1 min-2 d，混勻提取液，混勻后的提取液即為DNA樣品，取0.5μL-5μL該DNA樣品可以直接用于PCR擴增。
　　 2.通過多重PCR技術的研究，建立了一種通用多重PCR技術。對引物設計、PCR擴增體系和PCR擴增程序進行研究，并驗證該技術的可行性，得出通用多重PCR技術的實施方式。將上游引物的通用接頭序列（5’-CTCGTAGACTGCGTACCA-3’）加在上游引物的5’端，將下游引物的

4、通用接頭序列(5’-TACTCAGGACTCATCGTC-3’)加在下游引物的5’端，引物加上通用接頭后命名為通用接頭引物(U-primers)。通用多重PCR技術采用20μL擴增體系，其中每對U-primers的上下游引物（10μM）各0.5μL，10μL2×Power Taq PCR MasterMix(BioTeke，北京，中國)，2μL DNA（100 ng·μL-1或基于PCR的玉米半粒種子DNA快速提取法提取的DNA樣品），

5、用滅菌后的DEPC ddH2O補足20μL。通用多重PCR擴增程序采用一種新穎的模式，命名為“兩段循環(huán)模式”:①預變性(94℃，5min)。②第一段循環(huán)（循環(huán)數(shù):3）命名為“逐一退火循環(huán)”:變性(94℃，40 s);按照未加通用接頭前的多對引物的退火溫度從高到低的順序逐一退火（在設定退火溫度時，退火溫度相近的可以合并為一個溫度），每個退火溫度的退火時間為20 s;延伸(72℃，30s)。③第二段循環(huán)（循環(huán)數(shù):28-32，通常為30）:變