大型海藻孔石莼對赤潮微藻克生作用的實驗研究及其克生物質(zhì)的分離與鑒定.pdf

1、隨著沿海水域富營養(yǎng)化的加劇，“赤潮”(海洋有害微藻藻華)在世界范圍內(nèi)的沿海水域頻繁發(fā)生，已成為一種嚴(yán)重的世界性海洋災(zāi)害。我國由赤潮引起的直接經(jīng)濟損失每年達(dá)10億元以上。如何科學(xué)、有效地進行赤潮的治理和控制，已成為迫切需要解決的世界性重大問題；尋找方便有效、低投入、對環(huán)境相對無害的赤潮防治方法為目前所急需。迄今為止，國內(nèi)外學(xué)者探索了許多方法預(yù)防和控制赤潮，包括物理法(絮凝法，如粘土)、化學(xué)法(藥劑法，如硫酸銅)、生物防治法(微生物，如細(xì)菌

2、、病毒)等，但在實際中大規(guī)模應(yīng)用的尚很少，有些方法對近海生態(tài)系統(tǒng)會產(chǎn)生破壞作用。 另一方面，沿海水域的富營養(yǎng)化也導(dǎo)致了“綠潮”(海洋大型綠藻藻華)問題日益突出。大量象孔石莼、緣管滸苔等的大型綠藻在沿海漂浮和堆積，給沿海漁業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)和旅游業(yè)造成重大損失。如何有效地利用這些綠藻資源，減少綠潮帶來的經(jīng)濟損失也是急待解決的課題。 對于赤潮，生物防治是其治理的發(fā)展趨勢。生物防治對環(huán)境的影響相對較小，甚至具有保護作用。這一防治策略對

3、海洋生態(tài)環(huán)境良性循環(huán)的建立與維護，以及對海洋經(jīng)濟的可持續(xù)性發(fā)展，具有重要的現(xiàn)實意義。目前，有關(guān)赤潮的研究中，海洋化學(xué)生態(tài)學(xué)已經(jīng)成為新興的國際前沿研究領(lǐng)域。相生相克是水域生態(tài)系統(tǒng)中普遍存在的自然現(xiàn)象，包括各種生物之間的生長促進和抑制作用。本文研究了大型綠藻孔石莼對幾種赤潮微藻的克生作用，并初步分離和鑒定了其抑制赤潮微藻生長的克生物質(zhì)，探討了孔石莼對赤潮微藻克生作用的化學(xué)物質(zhì)本質(zhì)，為利用綠潮生物來治理赤潮生物提供科學(xué)依據(jù)。主要實驗結(jié)果如下：

4、 1.兩種不同品系的孔石莼對赤潮異彎藻和亞歷山大藻的克生效應(yīng)利用長期共存培養(yǎng)系統(tǒng)研究了不同初始濃度無性系和有性系孔石莼(Ulvapertusa)新鮮組織和干粉末對赤潮異彎藻(Heterosigmaakashiwo)和亞歷山大藻(Alexandriumtamarense)生長的克生作用，并檢驗了大藻培養(yǎng)水過濾液對這兩種赤潮微藻的作用。建立了分隔共培養(yǎng)系統(tǒng)以排除大藻對兩種赤潮微藻生長的直接接觸抑制作用，證明了克生物質(zhì)的存在。研究了兩

5、系孔石莼對赤潮異彎藻的短期殺藻作用并得出了赤潮異彎藻在兩系孔石莼作用下的細(xì)胞溶解率。共存實驗結(jié)果表明，兩系孔石莼的新鮮組織和干粉末對赤潮異彎藻和亞歷山大藻的生長均有強烈的抑制作用，在較高濃度下還能完全殺死赤潮異彎藻細(xì)胞。而兩種微藻在一次性和半連續(xù)大藻培養(yǎng)水過濾液添加方式下生長都沒有受到明顯抑制，表明兩系孔石莼所分泌的克生物質(zhì)容易降解；在干、鮮重相當(dāng)時，兩系孔石莼新鮮組織比其干粉末更能有效地抑制兩種微藻的生長，表明大藻新鮮組織內(nèi)克生物質(zhì)的

6、連續(xù)分泌是有效抑制兩種赤潮微藻生長的關(guān)鍵。 2.孔石莼和緣管滸苔對海洋原甲藻生長的克制作用利用共存培養(yǎng)系統(tǒng)研究了不同初始濃度的兩種能形成藻華的大型綠藻孔石莼(Ulvapertusa)和緣管滸苔(Ulvalinza)新鮮組織和干粉末對赤潮微藻海洋原甲藻(Prorocentrummicans)生長的克生作用，并檢驗了大藻培養(yǎng)水過濾液對這種赤潮藻的作用。另外還研究了海洋原甲藻對這兩種大型綠藻生長的作用。初步研究了這兩種大型綠藻的蒸餾水

7、及四種有機溶劑(甲醇、丙酮、乙醚和氯仿)抽提物對海洋原甲藻的殺藻作用，以證實這兩種大型綠藻組織中有克生物質(zhì)存在。共存實驗結(jié)果表明，兩種大型綠藻的新鮮組織和干粉末對海洋原甲藻的生長均有強烈的抑制作用，并且在較高濃度的大藻作用下，海洋原甲藻完全死亡。海洋原甲藻在一次性大藻培養(yǎng)水過濾液添加方式下生長沒有受到明顯抑制，而在半連續(xù)添加方式下，其生長受到了顯著抑制。表明這兩種大型綠藻所分泌的克生物質(zhì)容易降解；并且其新鮮組織內(nèi)微量克生物質(zhì)的連續(xù)分泌是

8、有效克制海洋原甲藻生長的關(guān)鍵。相反，海洋原甲藻對這兩種大型綠藻的生長沒有明顯的作用。這兩種大型綠藻的蒸餾水與甲醇抽提物對海洋原甲藻的生長有強烈的抑制作用，而其他三種極性較低的有機溶劑抽提物對海洋原甲藻的生長沒有明顯的作用，表明這兩種大型綠藻組織內(nèi)所含有的克生物質(zhì)具有較高的極性。 3.無性系孔石莼組織提取物對三種赤潮藻的生長抑制作用研究了不同濃度的無性系孔石莼(Ulvapertusa)組織蒸餾水及4種具有不同極性的有機溶劑(極性從

9、高到低：甲醇＞丙酮＞乙醚＞氯仿)提取物對三種典型的赤潮藻：赤潮異彎藻(Heterosigmaakashiwo)、亞歷山大藻(Alexandriumtamarense)和海洋原甲藻(Prorocentrummicans)的生長抑制作用?？资唤M織甲醇提取物在5種提取物中具有最高的生長抑制活性。在相對較高濃度的此種提取物作用下，三種赤潮藻均完全死亡。較高濃度的孔石莼組織蒸餾水提取物對三種赤潮藻的生長均有顯著的抑制作用，但是在最高的濃度下也不

10、能使三種赤潮藻完全死亡。另外3種有機溶劑的提取物對三種赤潮藻的生長沒有明顯的影響。結(jié)果表明，孔石莼組織中確實含有對三種赤潮藻的生長有抑制作用的活性物質(zhì)，且這些物質(zhì)具有相對較高的極性。三種赤潮藻對孔石莼組織提取物的敏感程度也不同，赤潮異彎藻最敏感，海洋原甲藻次之，亞歷山大藻最不敏感。 4.孔石莼組織內(nèi)克生物質(zhì)的提取、分離與鑒定將3.85kg的孔石莼(Ulvapertusa)干粉末用甲醇抽提得到320g粗提物浸膏，然后將浸膏萃取分離

11、為石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和蒸餾水相。對這4個相進行了高效液相色譜(HPLC)分析，然后對石油醚相和乙酸乙酯相進行了氣相色譜—質(zhì)譜(GC/MS)聯(lián)用分析。并且用赤潮異彎藻(Heterosigmaakashiwo)進行各個分離組分的克生活性檢測。活性檢測表明石油醚相和乙酸乙酯相具有很強的殺藻活性，GC/MS分析鑒定其中的16種脂肪酸，其中不飽和脂肪酸占大部分。純化合物活性檢測表明9，12，15-十八碳三烯酸、6，9，12，15-十八

12、碳四烯酸、5Z，8Z，1lZ，14Z-二十碳四烯酸、5Z，11Z，14Z，17Z-二十碳四烯酸和5Z，8Z，11Z，14Z，17Z-二十碳五烯酸具有很強的殺藻活性，其有效濃度在5mgl-1以下。實驗結(jié)果表明，孔石莼組織中含有多種不飽和脂肪酸，其中一些對赤潮異彎藻具有強烈的殺藻作用，表明不飽和脂肪酸可能是孔石莼組織內(nèi)抑制赤潮微藻生長的克生物質(zhì)的重要組成成分之一。 5.非營養(yǎng)環(huán)境因子對孔石莼克制赤潮異彎藻效果和兩者生長的影晌研究了不

13、同水平的溫度(10、15、25和30℃)、鹽度(10、20、30和40ppt)、光照(20、100、200和400μmolm-2s-1)和pH值(5.5、7、8.5和10)這四個非營養(yǎng)環(huán)境因子兩兩因子處理組合對大型海洋綠藻孔石莼(Ulvapertusa)和海洋赤潮微藻赤潮異彎藻(Heterosigmaakashiwo)生長和孔石莼克制赤潮異彎藻效果的影響，得出了孔石莼和赤潮異彎藻平均生長率及大藻克制微藻生長抑制率與以上四個因子兩兩之間的

14、非線性回歸方程。溫度、鹽度、光照和pH值兩兩因子組合對孔石莼和赤潮異彎藻的平均生長率及大藻克制微藻生長抑制率均有顯著的影響(p＜0.01)，孔石莼生長最適環(huán)境條件為：20-25℃、30ppt、200-400μmolm-2s-1和pH=8.5-10；赤潮異彎藻生長最適環(huán)境條件為：25℃、30ppt、100μmolm-2s-1和pH=8.5。適當(dāng)?shù)臏囟?25℃)、較低的鹽度(10ppt)、較高的光照強度(400μmolm-2s-1)和高pH

15、值(10)均能增強孔石莼克制赤潮異彎藻的效果。二次回歸方程能較好地反映以上3個因變量與每2個環(huán)境因子間的相互關(guān)系。 6.不同N、P營養(yǎng)水平對孔石莼克制赤潮異彎藻效果的影響研究了4個不同營養(yǎng)水平的(N、P營養(yǎng)充足、N限制、P限制和N、P雙限制)大型海藻孔石莼(Ulvapertusa)對同樣4個不同營養(yǎng)水平的海洋赤潮微藻赤潮異彎藻(Heterosigmaakashiwo)的克制效果。不同的N、P營養(yǎng)狀況能夠顯著影響孔石莼克制赤潮異彎